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重组新城疫病毒rNDV-IL15在黑色素瘤治疗中的效果

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药学学报 2014年第3期49卷 310-315页

作者：牛泽杉白福良孙田田辉尹杰超曹宏伟于丹田贵游吴云舟李德山任桂萍东北农业大学生命科学学院黑龙江哈尔滨150030 黑龙江八一农垦大学生命科学学院黑龙江大庆163319

为了提高重组新城疫病毒抑制肿瘤的效果,本实验拯救获得了重组新城疫病毒rNDV-IL15。构建prNDV-IL15重组质粒,转染BHK21细胞后,拯救重组病毒rNDV-IL15,并测定病毒生长曲线;rNDV-IL15以0.1 MOI感染B16F10细胞,ELISA法检测细胞上清液中IL1... 详细信息

为了提高重组新城疫病毒抑制肿瘤的效果,本实验拯救获得了重组新城疫病毒rNDV-IL15。构建prNDV-IL15重组质粒,转染BHK21细胞后,拯救重组病毒rNDV-IL15,并测定病毒生长曲线;rNDV-IL15以0.1 MOI感染B16F10细胞,ELISA法检测细胞上清液中IL15的表达量;MTT法比较rNDV-IL15和rNDV在体外抑制B16F10细胞的效果,并比较了两者在黑色素瘤肿瘤模型中对荷瘤小鼠的治疗效果。结果表明,rNDV-IL15构建并成功拯救;病毒生长曲线表明,插入IL15后对病毒的生长无影响;IL15在细胞上清液中有较高的表达,达到(1 044.3±27.7)ng·mL-1;rNDV-IL15和rNDV对B16F10细胞的抑制率呈时间依赖性,但两者的抑制率无显著差异;与rNDV相比,rNDV-IL15在体内能较明显地抑制肿瘤生长。结果提示,rNDV-IL15是一种更有效的抗肿瘤制剂。

关键词：重组新城疫病毒 IL15 rNDV-IL15 黑色素瘤 B16F10 抗肿瘤制剂

重组新城疫病毒rClone30-hDR5联合TRAIL对人肝癌细胞的协同作用及其机制探讨

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药学学报 2014年第7期49卷 985-992页

作者：孙田牛泽杉刘雪莹田贵游白银白福良尹杰超于丹吴云舟李德山于庆忠李思明任桂萍东北农业大学生命科学学院黑龙江哈尔滨150030 美国农业部美国东南家禽研究所

为研究重组新城疫病毒rClone30-hDR5联合TRAIL蛋白对人肝癌细胞株HepG2的杀伤作用及其机制,首先将pee12.4-hDR5转染HepG2细胞,利用流式细胞仪筛选,建立了细胞表面稳定高效表达DR5的HepG2细胞系。利用MTT法检测TRAIL对该细胞和对照HepG2... 详细信息

为研究重组新城疫病毒rClone30-hDR5联合TRAIL蛋白对人肝癌细胞株HepG2的杀伤作用及其机制,首先将pee12.4-hDR5转染HepG2细胞,利用流式细胞仪筛选,建立了细胞表面稳定高效表达DR5的HepG2细胞系。利用MTT法检测TRAIL对该细胞和对照HepG2细胞的抑制率,表明TRAIL对该细胞的抑制率显著高于对照HepG2细胞(P<0.01),证明了克隆的hDR5具有生物学活性;与rClone30-hDR5组和TRAIL组相比,rClone30-hDR5联合TRAIL在体外能更好地抑制HepG2细胞的生长。Annexin V-FITC/PI染色和Quantitative Real-time PCR结果表明,与其他组相比,rClone30-hDR5联合TRAIL显著提高caspase 3和caspase 8的mRNA表达水平并协同诱导细胞凋亡。以1 MOI感染HepG2细胞,流式细胞仪检测证明,与rClone30相比,rClone30-hDR5能显著诱导hDR5的表达上调,从而增加肿瘤细胞对TRAIL的敏感性。综上所述,rClone30-hDR5联合TRAIL在肿瘤治疗方面存在潜在的应用价值。

关键词： DR5 TRAIL 重组新城疫病毒肿瘤治疗

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重组新城疫病毒对肝癌肺转移鼠的治疗效果

东北农业大学学报 2019年第5期50卷 62-70页

作者：李德山杨甲瑞苏明雪吴红松刘天艳张宇刘涵王凯东北农业大学生命科学学院哈尔滨150030 哈尔滨医科大学分子影像研究中心哈尔滨150028

文章利用重组新城疫病毒(rNDA)治疗肝癌肺转移鼠,将免疫调节基因白细胞介素2(IL2)插入rNDV基因组,拯救获得rNDV-IL2。MTT法检验rNDV-IL2对肝癌HepG2细胞体外抑制效果。通过小鼠尾静脉注射H22肝癌细胞,构建肝癌细胞肺转移模型,腹腔注射r... 详细信息

文章利用重组新城疫病毒(rNDA)治疗肝癌肺转移鼠,将免疫调节基因白细胞介素2(IL2)插入rNDV基因组,拯救获得rNDV-IL2。MTT法检验rNDV-IL2对肝癌HepG2细胞体外抑制效果。通过小鼠尾静脉注射H22肝癌细胞,构建肝癌细胞肺转移模型,腹腔注射rNDV和rNDV-IL2,治疗肝癌肺转移模型小鼠。结果表明,rNDV-IL2有效感染HepG2细胞,表达外源基因IL2并抑制HepG2细胞增殖。重组新城疫病毒rNDV-IL2治疗试验动物后,体内IL2基因表达量提高,重组新城疫病毒有效控制转移灶形成,且显著促进T细胞增殖,提高试验动物存活率,未治疗组、rDNV载体治疗组和rNDV-IL2治疗组30d成活率分别为0、50%和77.8%。

关键词：重组新城疫病毒 IL2 H22 肝癌肺转移模型

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重组新城疫病毒对肺癌荷瘤鼠的治疗效果研究

东北农业大学学报 2018年第11期49卷 1-8,17页

作者：李德山张旭刘云野田贵游孙田安莹陈睿东北农业大学生命科学学院哈尔滨150030

新城疫病毒用于肿瘤治疗具有良好靶向性和安全性,在众多溶瘤制剂中有独特优势。试验通过反向遗传操作技术成功拯救3株重组新城疫病毒r Clone30-IL2、r Clone30-P53和r Clone30-P53-IL2。经RT-PCR鉴定,表明插入新城疫病毒基因组中IL2、P5... 详细信息

新城疫病毒用于肿瘤治疗具有良好靶向性和安全性,在众多溶瘤制剂中有独特优势。试验通过反向遗传操作技术成功拯救3株重组新城疫病毒r Clone30-IL2、r Clone30-P53和r Clone30-P53-IL2。经RT-PCR鉴定,表明插入新城疫病毒基因组中IL2、P53基因和P53-IL2双基因均插入预期位置,未发生突变。重组新城疫病毒在DF-1细胞中生长曲线表明,其与原代毒株生长特征相同。重组病毒在鸡胚中增殖稳定性试验表明,外源基因插入未影响重组病毒在鸡胚中增殖能力。体外肿瘤细胞生长抑制试验表明,与空载体r Clone30相比,r Clone30-IL2、r Clone30-P53和r Clone30-P53-IL2对LLC肺肿瘤细胞生长抑制效果更显著(P重组新城疫病毒对肺肿瘤治疗效果优于单一抗肿瘤相关因子。研究为筛选先导病毒治疗肺癌奠定基础。

关键词：重组新城疫病毒反向遗传操作技术肺肿瘤

重组新城疫病毒rL-RVG抑制人肺腺癌细胞系增殖

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基础医学与临床 2023年第10期43卷 1549-1556页

作者：张珍珍李洋高生宝夏德鑫严玉兰江苏大学附属人民医院呼吸内科江苏镇江212000 江苏大学医学院临床医学系江苏镇江212000 香港大学深圳医院呼吸内科广东深圳518000

目的探讨表达狂犬病毒糖蛋白的重组新城疫病毒rL-RVG抑制人肺腺癌细胞系A549和PC9增殖。方法体外培养人肺腺癌细胞系A549、PC9,将处于对数增殖期的细胞分为对照组、新城疫病毒感染组(NDV)、重组新城疫病毒感染组(rL-RVG)、铁死亡诱导剂... 详细信息

目的探讨表达狂犬病毒糖蛋白的重组新城疫病毒rL-RVG抑制人肺腺癌细胞系A549和PC9增殖。方法体外培养人肺腺癌细胞系A549、PC9,将处于对数增殖期的细胞分为对照组、新城疫病毒感染组(NDV)、重组新城疫病毒感染组(rL-RVG)、铁死亡诱导剂组(Erastin)和重组新城疫病毒联合铁死亡诱导剂组(rL-RVG+Erastin)。病毒及药物感染细胞24 h后,光学显微镜下观察细胞形态,CCK-8法检测细胞增殖能力,划痕试验检测细胞迁移能力,细胞毒性检测试剂盒测定乳酸脱氢酶(LDH)释放量,流式细胞术检测细胞内活性氧(ROS)含量,Western blot检测铁死亡相关蛋白p53、SLC7A11、GPX4的表达。结果与对照组相比,NDV组、rL-RVG组、Erastin组细胞数、细胞增殖能力及迁移的距离明显降低(P均病毒在治疗肿瘤中的关键作用。

关键词：重组新城疫病毒新城疫病毒 Erastin 细胞增殖肺腺癌

重组新城疫病毒IL29抑制人胃癌细胞系BGC的增殖与迁移

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基础医学与临床 2020年第3期40卷 368-373页

作者：尹超云张垚陈振威张安伟张旋风张日亭步雪峰江苏大学附属医院血管外科江苏镇江212000 江苏大学医学院江苏镇江212013 江苏大学附属人民医院普外科江苏镇江212002

目的探讨表达IL-29的重组新城疫病毒Lo Sota株(rL-IL29)对人胃癌BGC细胞增殖及迁移的影响及其机制。方法将体外培养的人胃癌BGC细胞分为对照组、rL-IL29组和Lo Sota株新城疫病毒(NDV)组,分别经PBS、rL-IL29及NDV感染处理后进行下一步实... 详细信息

目的探讨表达IL-29的重组新城疫病毒Lo Sota株(rL-IL29)对人胃癌BGC细胞增殖及迁移的影响及其机制。方法将体外培养的人胃癌BGC细胞分为对照组、rL-IL29组和Lo Sota株新城疫病毒(NDV)组,分别经PBS、rL-IL29及NDV感染处理后进行下一步实验。蛋白质印迹检测BGC细胞中IL-29、NDV、P-ERK、MMP2、p-AKT蛋白的表达;CCK8法、划痕试验及Transwell小室法侵袭实验检测胃癌BGC细胞的增殖、迁移能力。结果IL-29蛋白仅在rL-IL29组表达,NDV蛋白在IL-29组及NDV组均稳定表达,且明显高于PBS组(P<0.05);rL-IL29感染BGC细胞后BGC细胞的增殖及迁移能力明显减弱,且rL-IL29的抑制较NDV组作用更强;BGC细胞经rL-IL29感染后P-ERK、MMP2(66 ku/72 ku)、p-AKT蛋白表达较对照组及NDV组明显减弱(P<0.05)。结论rL-IL29抑制胃癌BGC细胞的增殖、侵袭及迁移可能与ERK,AKT等信号通路相关。

关键词：重组新城疫病毒白细胞介素-29 胃癌BGC细胞增殖迁移

重组新城疫病毒rNDV-IP10的构建与拯救及抗肝癌效果的研究

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重组新城疫病毒rNDV-IP10的构建与拯救及抗肝癌效果的研究

作者：郭顺利广西医科大学

学位级别：硕士

目的:新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)作为自然溶瘤药物在治疗癌症方面已显示较好的应用前景。干扰素γ诱导蛋白10(IFN-gamma-inducible protein 10,IP10)为趋化因子,能特异性的趋化CD4、CD8、NK细胞等免疫细胞,此类免疫细胞... 详细信息

目的:新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)作为自然溶瘤药物在治疗癌症方面已显示较好的应用前景。干扰素γ诱导蛋白10(IFN-gamma-inducible protein 10,IP10)为趋化因子,能特异性的趋化CD4、CD8、NK细胞等免疫细胞,此类免疫细胞对肿瘤细胞具有特异性杀伤作用。为了进一步提高新城疫病毒的溶瘤效果,我们利用反向遗传学技术构建并拯救出能表达IP10蛋白的重组新城疫病毒(rNDV-IP10),同时检测rNDV-IP10是否能够具有更好的杀伤肿瘤细胞的能力。方法:(1)使用同源重组酶将IP10基因和增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因插入到新城疫病毒转录载体中,与辅助质粒pBS-NP、pBS-P和pBS-L共转染入BSR-T7/5细胞中,拯救出重组新城疫病毒,命名为rNDV-IP10。(2)通过原代鸡胚成纤维细胞(primary chicken embryonic fibroblast,PCEF)检测不同时间点rNDV-IP10的滴度,进而测得病毒的生长动力学。通过间接免疫荧光技术检测感染了rNDV-IP10的仓鼠肾细胞表达外源基因IP10的情况。(3)使用NDV和rNDV-IP10感染肝癌细胞,通过荧光定量PCR检测IP10基因mRNA的表达量。通过Western blot和ELISA分别检测rNDV-IP10在肝癌细胞和细胞培养上清中IP10表达情况。通过CCK8实验测定外源基因的插入对重组新城疫病毒毒力的影响。(4)使用H22肝癌细胞建立小鼠实验动物肿瘤模型。待12天肿瘤模型建成后随机分为三组,分别注射PBS、NDV和rNDV-IP10。然后测量肿瘤体积。(5)注射药物后的第12天处死小鼠取肿瘤组织。通过流式细胞仪检测肿瘤组织内CD4、CD8淋巴细胞水平。通过HE染色和免疫组化测定肿瘤组织内淋巴细胞浸润情况。通过免疫组化检测肿瘤组织内CD31的表达量,浅棕色或深棕色为阳性反应颗粒。结果:(1)成功构建了携带IP10和EGFP基因的重组新城疫病毒转录载体pMD18-IP10。利用反向遗传学技术拯救了重组新城疫病毒rNDV-IP10。(2)通过病毒生长曲线可以看出,外源基因的插入对rNDV-IP10的生长复制没有产生影响。通过间接免疫荧光技术可以看到感染了rNDV-IP10的仓鼠肾细胞中有特异性的红色荧光。(3)感染了rNDV-IP10的肝癌细胞能高效转录出IP10 mRNA,并能够翻译出IP10蛋白且能顺利分泌到细胞外。外源基因的插入对新城疫病毒的毒力没有产生影响。(4)成功建立了小鼠肝癌肿瘤模型。rNDV-IP10组小鼠肿瘤体积相比于NDV组和PBS组生长速度较慢,瘤体较小(P重组新城疫病毒rNDV-IP10。(2)rNDV-IP10的生物特性没有受到外源基因的影响,并能够顺利翻译外源基因IP10。(3)rNDV-IP10在肝癌动物模型中具有更好的抑瘤效果。

关键词： IP10 重组新城疫病毒肝细胞癌

重组新城疫病毒表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的研究

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中国预防兽医学报 2014年第12期36卷 979-981页

作者：王子龙葛金英王云鹤于桂梅孙继国步志高河北农业大学动物医学学院河北保定071000 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

为构建表达猪圆环病毒2型(PCV2)衣壳蛋白(Cap)的重组新城疫病毒(NDV),本研究利用NDV La Sota弱毒疫苗株为活病毒载体,通过反向遗传操作系统构建出表达PCV2 Cap的重组病毒(r La-PCV2/Cap),以及表达删除核定位信号(NLS)的Cap(CapΔ41)的... 详细信息

为构建表达猪圆环病毒2型(PCV2)衣壳蛋白(Cap)的重组新城疫病毒(NDV),本研究利用NDV La Sota弱毒疫苗株为活病毒载体,通过反向遗传操作系统构建出表达PCV2 Cap的重组病毒(r La-PCV2/Cap),以及表达删除核定位信号(NLS)的Cap(CapΔ41)的重组病毒(r La-PCV2/CapΔ41),并对外源蛋白的表达效果进行了检测。通过间接免疫荧光试验证明,两种重组病毒感染的BHK-21细胞中,PCV2 Cap蛋白以及删除NLS的CapΔ41蛋白均获得正确表达;其中,完整的Cap蛋白定位于核内,而删除NLS的CapΔ41蛋白则定位于胞浆中,本研究结果为研究新型PCV2疫苗奠定基础。

关键词：猪圆环病毒2型重组新城疫病毒 Cap蛋白核定位信号

重组新城疫病毒rClone30-CD的构建及其抑制肿瘤效果的研究

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重组新城疫病毒rClone30-CD的构建及其抑制肿瘤效果的研究

作者：吕政东北农业大学

学位级别：硕士

恶性肿瘤是威胁人类健康的重大疾病，尽管针对肿瘤治疗的手段已有较大的改善和提高，但仍不能明显提高对肿瘤的抑制效率和增加患者的生存几率。传统的治疗手段有放射疗法和化学疗法，但二者的治疗存在很大风险，治疗过程还会给患者带来... 详细信息

恶性肿瘤是威胁人类健康的重大疾病，尽管针对肿瘤治疗的手段已有较大的改善和提高，但仍不能明显提高对肿瘤的抑制效率和增加患者的生存几率。传统的治疗手段有放射疗法和化学疗法，但二者的治疗存在很大风险，治疗过程还会给患者带来痛苦且存在副作用。手术切除肿瘤法，虽然可以去除病灶，但依然有肿瘤扩散和复发的可能性。新城疫病毒（Newcastledisease virus，NDV）为不分节段的单股负链RNA病毒，隶属于副粘病毒科禽副粘病毒属。上世纪六十年代，研究发现NDV可用于治疗人类肿瘤，其可在肿瘤细胞中进行特异性复制，同时对正常细胞并无明显的影响。反向遗传操作技术已经成熟建立，目前应用十分广泛。研究者可以利用该技术对病毒基因组加以改造，使野生型毒株的抗肿瘤效果得以提升。本研究将自杀基因CD插入到重组新城疫病毒的基因组中，并通过反向遗传操作技术拯救病毒，协同5氟胞嘧啶（5-flucytosine，5-FC），增加治疗的靶向性，达到抑制肿瘤的目的。 CD（Cytosine deaminase）为自杀基因家族的成员之一，它存在于大肠杆菌或酵母菌等基因组当中，在哺乳动物体内并不存在。CD可将相应的无毒前导药物（prodrug）5-FC转化为具有毒性的抗肿瘤药物5氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU），后者可引起肿瘤细胞死亡。通过克隆技术获得大肠杆菌E.coli JM109菌株全基因组中的CD基因，构建成真核表达质粒pEE12.4-CD-IRES-EGFP（pEE12.4IE-CD）并转染HepG2细胞，为验证CD表达产物的体外生物学活性，以不同浓度的5-FC孵育单层细胞，采用MTT法检测细胞的死亡率，结果表明CD转化5-FC效果良好，HepG2细胞生长受到显著抑制。携带自杀基因进入细胞的常用载体有慢病毒和腺病毒，这两种载本身并不具备杀伤肿瘤的作用。而利用自身具有抗肿瘤能力的新城疫病毒作为载体，携带CD基因进入肿瘤细胞，可以增强二者的抗肿瘤能力。本研究首次利用反向遗传操作技术在重组新城疫病毒弱毒株LaSota rClone30基因组的F基因和HN基因之间插入了CD基因的开放阅读框，构建带有CD基因的NDV全长cDNA转录质粒pBrClone30-CD。将该转录质粒与表达核衣壳蛋白、磷酸化蛋白以及大聚合酶蛋白的辅助质粒，共同转染能够稳定表达T7RNA聚合酶的BHK-21细胞，拯救后获得的重组新城疫病毒于SPF鸡胚中进行增殖，并收集尿囊液进行血凝和血凝抑制实验，重组病毒命名为重组新城疫病毒rClone30-CD株。通过在鸡胚中连续传代8代，确定插入CD基因的新城疫病毒可以稳定增殖。说明CD基因片段的插入并未对病毒复制能力造成影响。在体外实验中，采用MTT法检测不同MOI的重组新城疫病毒对HepG2细胞的抑制作用。结果表明，重组病毒可以有效地抑制HepG2细胞的生长，并呈现剂量依赖性。在较高的MOI条件下，rClone30-CD/5-FC抑制效果明显大于rClone30-CD，说明重组新城疫病毒与前导药物5-FC协同效果显著。在体内实验中，我们首先对5-FC的半数致死量（LD50）和最大安全剂量进行测定，保证实验小鼠的安全和药物注射剂量的最优化。建立昆明小鼠H22腹股沟皮下荷瘤模型，通过瘤内注射重组新城疫病毒，并采用瘤内或尾静脉两种不同的方式注射5-FC，达到协同治疗肿瘤的目的。实验结果表明，与rClone30-CD治疗组相比，rClone30-CD/5-FC抑制肿瘤生长的效果明显，重组新城疫病毒与前导药物5-FC协同效果显著，而且可以提高小鼠的存活率。两种不同给药方法所得到结果一致，说明瘤内注射或尾静脉注射5-FC，均能达到良好的抑制肿瘤目的。对小鼠血样中5-FU的含量进行测定，在rClone30-CD/5-FC组的样本中检测到5-FU的存在，5-FC组未检出5-FU。结果表明，插入到NDV中的外源CD基因具有生物学活性，可将5-FC转化为5-FU，并且由于5-FU的存在，使得rClone30-CD/5-FC的抗肿瘤作用显著提升。综上所述，本研究应用反向遗传操作技术，成功拯救重组NDV rClone30-CD，体外实验证实重组NDV rClone30-CD/5-FC能有效的杀伤HepG2细胞。在体内试验中，采用两种不同方法进行5-FC给药，rClone30-CD/5-FC均能达到良好的抑制肿瘤细胞效果，并且可以延长实验小鼠的存活时间。本研究为提高NDV弱毒株治疗肿瘤效果以及为重组新城疫病毒作为自杀基因的载体，应用于恶性肿瘤的靶向治疗奠定良好的基础。

关键词：重组新城疫病毒反向遗传操作技术自杀基因胞嘧啶脱氨酶肿瘤细胞荷瘤鼠模型