重组新城疫病毒rNDV-IP10的构建与拯救及抗肝癌效果的研究

作     者：郭顺利 

作者单位：广西医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：周素芳

授予年度：2018年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：IP10 重组新城疫病毒 肝细胞癌 

摘      要：目的:新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)作为自然溶瘤药物在治疗癌症方面已显示较好的应用前景。干扰素γ诱导蛋白10(IFN-gamma-inducible protein 10,IP10)为趋化因子,能特异性的趋化CD4、CD8、NK细胞等免疫细胞,此类免疫细胞对肿瘤细胞具有特异性杀伤作用。为了进一步提高新城疫病毒的溶瘤效果,我们利用反向遗传学技术构建并拯救出能表达IP10蛋白的重组新城疫病毒(rNDV-IP10),同时检测rNDV-IP10是否能够具有更好的杀伤肿瘤细胞的能力。方法:(1)使用同源重组酶将IP10基因和增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因插入到新城疫病毒转录载体中,与辅助质粒pBS-NP、pBS-P和pBS-L共转染入BSR-T7/5细胞中,拯救出重组新城疫病毒,命名为rNDV-IP10。(2)通过原代鸡胚成纤维细胞(primary chicken embryonic fibroblast,PCEF)检测不同时间点rNDV-IP10的滴度,进而测得病毒的生长动力学。通过间接免疫荧光技术检测感染了rNDV-IP10的仓鼠肾细胞表达外源基因IP10的情况。(3)使用NDV和rNDV-IP10感染肝癌细胞,通过荧光定量PCR检测IP10基因mRNA的表达量。通过Western blot和ELISA分别检测rNDV-IP10在肝癌细胞和细胞培养上清中IP10表达情况。通过CCK8实验测定外源基因的插入对重组新城疫病毒毒力的影响。(4)使用H22肝癌细胞建立小鼠实验动物肿瘤模型。待12天肿瘤模型建成后随机分为三组,分别注射PBS、NDV和rNDV-IP10。然后测量肿瘤体积。(5)注射药物后的第12天处死小鼠取肿瘤组织。通过流式细胞仪检测肿瘤组织内CD4、CD8淋巴细胞水平。通过HE染色和免疫组化测定肿瘤组织内淋巴细胞浸润情况。通过免疫组化检测肿瘤组织内CD31的表达量,浅棕色或深棕色为阳性反应颗粒。结果:(1)成功构建了携带IP10和EGFP基因的重组新城疫病毒转录载体pMD18-IP10。利用反向遗传学技术拯救了重组新城疫病毒rNDV-IP10。(2)通过病毒生长曲线可以看出,外源基因的插入对rNDV-IP10的生长复制没有产生影响。通过间接免疫荧光技术可以看到感染了rNDV-IP10的仓鼠肾细胞中有特异性的红色荧光。(3)感染了rNDV-IP10的肝癌细胞能高效转录出IP10 mRNA,并能够翻译出IP10蛋白且能顺利分泌到细胞外。外源基因的插入对新城疫病毒的毒力没有产生影响。(4)成功建立了小鼠肝癌肿瘤模型。rNDV-IP10组小鼠肿瘤体积相比于NDV组和PBS组生长速度较慢,瘤体较小(P0.05)。(5)HE染色和免疫组化结果显示,rNDV-IP10组肿瘤内淋巴细胞浸润多于NDV和PBS组(P0.05)。rNDV-IP10组肿瘤组织内CD4、CD8细胞比例多于NDV和PBS组(P0.05)。rNDV-IP10组肿瘤组织内新生血管密度下调,与NDV和PBS组相比差异具有统计学意义(P0.01)。结论:(1)成功拯救出携带IP10基因的重组新城疫病毒rNDV-IP10。(2)rNDV-IP10的生物特性没有受到外源基因的影响,并能够顺利翻译外源基因IP10。(3)rNDV-IP10在肝癌动物模型中具有更好的抑瘤效果。