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桑树原生质体分离条件的优化试验

蚕业科学 2012年第2期38卷 204-209页

作者：羿德磊王海朋崔为正袁传忠王洪利山东农业大学林学院农业生态与环境重点实验室山东泰安271018

为了分离获取高产量、高活力的桑树原生质体,分别以桑树的组培苗细切叶片、胚性悬浮培养细胞、粗切愈伤组织和细切愈伤组织等为材料,采用正交试验和单因素试验的方法对桑树原生质体酶解分离条件中的分离酶液组合、渗透压调节剂、酶解温... 详细信息

为了分离获取高产量、高活力的桑树原生质体,分别以桑树的组培苗细切叶片、胚性悬浮培养细胞、粗切愈伤组织和细切愈伤组织等为材料,采用正交试验和单因素试验的方法对桑树原生质体酶解分离条件中的分离酶液组合、渗透压调节剂、酶解温度、酶解时间等因素进行优化。最佳分离酶液组合为100 U/mL纤维素酶R-10+150 U/mL果胶酶Y-23+6 U/mL离析酶R-10+细胞-原生质体洗液(1 480 mg/L CaCl2.2H2O,27.2 mg/L KH2PO4),以0.6 mol/L甘露醇为渗透压调节剂,在28℃酶解温度条件下酶解6 h,用桑树胚性悬浮培养细胞作分离材料可获得7.8×106个/g的原生质体产量,且原生质体活力达91.4%。研究结果显示,选择合适的分离材料以及酶解分离条件是高效获取高活力桑树原生质体的关键。

关键词：桑树原生质体分离材料酶液组合渗透压调节剂酶解温度酶解时间

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山丹丹原生质体分离初探

山丹丹原生质体分离初探

作者：王珺华延安大学

学位级别：硕士

山丹丹(Lilium pumilum DC.)是集观赏、食用和药用功能于一体的百合科百合属植物,因耐寒旱、耐盐碱能力强成为百合属植物育种的优良资源来源,但百合属植物有性杂交育种时存在不亲和性,严重降低山丹丹基因资源的利用效率。原生质体是缺... 详细信息

山丹丹(Lilium pumilum DC.)是集观赏、食用和药用功能于一体的百合科百合属植物,因耐寒旱、耐盐碱能力强成为百合属植物育种的优良资源来源,但百合属植物有性杂交育种时存在不亲和性,严重降低山丹丹基因资源的利用效率。原生质体是缺失细胞壁、具有植物全套的遗传基因的活性细胞团,原生质体融合为植物育种提供新的途径,原生质体则为开展植物细胞水平、分子水平上的基础研究提供良好的实验平台,因此开展山丹丹原生质体的研究对于百合属植物优化育种、山丹丹种质资源理论研究均有重要的意义。为获得满足一定数量和活性要求的山丹丹原生质体。本研究以山丹丹鳞片诱导的愈伤组织为试验材料,设计正交试验探究纤维素酶、果胶酶和甘露醇对山丹丹原生质体产量和活性的影响,设计单因素试验探究酶解时间、纯化方式、预处理方式和培养条件对山丹丹原生质体分离和培养的影响,优化了山丹丹原生质体分离条件,进而建立了高效高产的山丹丹原生质体分离体系,为山丹丹的种质资源高效利用和理论研究提供支持和参考,具体工作如下:1.山丹丹原生质体分离最佳酶解时间为6 h,原生质体产量3.46×10个/mL,活性为39.17%。酶解条件为0.015 g/mL纤维素酶浓度,0.005 g/mL果胶酶浓度,0.12 g/mL甘露醇浓度,调节混合酶液pH=5.7,在黑暗条件、25℃和50 rpm震荡速度酶解。2.设计3因素4水平L(3)正交试验研究纤维素酶浓度(0.00 g/mL、0.01 g/mL、0.02 g/mL和0.03 g/mL)、果胶酶浓度(0.002 g/mL、0.004 g/mL、0.006 g/mL和0.008 g/mL)和甘露醇浓度(0.09 g/mL、0.11 g/mL、0.13 g/mL和0.15 g/mL)对山丹丹原生质体产量和活性的影响,正交试验酶解时间分别为3、6和9 h,影响原生质体产量的主次因素均为纤维素酶>果胶酶>甘露醇,影响原生质体活性的主次因素均为甘露醇>纤维素酶>果胶酶。对正交试验结果中纤维素酶、果胶酶和甘露醇3个因素在不同水平上的原生质体产量和活性进行显著性分析,得出3 h时正交试验最佳的组合为纤维素酶0.03g/mL+果胶酶0.006 g/mL+甘露醇0.11 g/mL,该条件下的时间成本最小;6 h时正交试验最佳的组合为纤维素酶0.02 g/mL+果胶酶0.006 g/mL+甘露醇0.11g/mL,该条件最有利于原生质体的产量和活性增加;9 h时正交试验最佳的组合为纤维素酶0.01 g/mL+果胶酶0.004 g/mL+甘露醇0.13 g/mL,该条件下药品成本最低。3.山丹丹原生质体分离最佳预处理方式为暗处理,本实验条件下,暗处理能够显著促进原生质体产量和活性的增加,原生质体产量从5.17×10个/mL增加至9.67×10个/mL,原生质体活性从21.21%增加至76.54%。酶解条件为0.02 g/mL纤维素酶+0.008 g/mL果胶酶+0.11 g/mL甘露醇,调节混合酶液pH=5.7,在黑暗条件、25℃和50 rpm震荡速度酶解6 h。4.山丹丹原生质体分离最佳离心条件是800000 r/min离心转速,10 min离心时间,原生质体产量为9.670×10个/mL,活性为33.872.24%,酶解条件为0.02 g/mL纤维素酶+0.008 g/mL果胶酶+0.11 g/mL甘露醇,调节混合酶液pH=5.7,在黑暗条件、25℃和50 rpm震荡速度下酶解6 h。

关键词：山丹丹原生质体酶液组合酶解时间离心条件

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山丹原生质体的分离条件探究

中国农学通报 2019年第34期35卷 64-71页

作者：王珺华王凯琪王凯孙志宏曹园齐向英延安大学/陕西省区域生物资源保育与利用工程技术研究中心

本研究旨在建立山丹高效原生质体分离体系,为山丹种质资源的有效利用提供科学依据。以山丹鳞茎胚性愈伤组织为材料,通过酶解法获得山丹原生质体,进一步采用3因素4水平L16(34)正交试验,对原生质体分离条件进行优化研究。结果表明:(1)在... 详细信息

本研究旨在建立山丹高效原生质体分离体系,为山丹种质资源的有效利用提供科学依据。以山丹鳞茎胚性愈伤组织为材料,通过酶解法获得山丹原生质体,进一步采用3因素4水平L16(34)正交试验,对原生质体分离条件进行优化研究。结果表明:(1)在预处理条件下(0.015 g/mL纤维素酶+0.005 g/mL果胶酶+0.65 mol/L甘露醇)得出最佳酶解时间为6 h,产量为3.47×10^6个/g。(2)对正交试验结果进行极差分析,确定原生质体产量主次因素为纤维素酶浓度>果胶酶浓度>甘露醇浓度,同时得到最佳酶组合为0.02 g/mL纤维素酶、0.008 g/mL果胶酶,最佳渗透压浓度为0.6 mol/L甘露醇,原生质体产量最高为3.47×10^6个/g,活性为60.32%。(3)在最佳酶组合处理下,采用暗处理可将原生质体活性提高到76.15%;在15 min、1000 r/min时,原生质体产量最高,为3.51×10^6个/g;在10 min、800 r/min时,原生质体活性最高,为61.2%。试验获得了山丹原生质体最佳分离条件,建立原生质体分离体系,可为山丹种质资源的有效利用提供参考。

关键词：山丹原生质体正交试验设计酶液组合酶解时间离心条件

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水曲柳原生质体分离初探

生物技术 2021年第2期31卷 183-188页

作者：王姿童宋悦悦刘林薛佳丽詹亚光齐凤慧东北林业大学生命科学学院黑龙江哈尔滨150040

[目的]通过优化限制因素,探索水曲柳原生质体制备的最佳方法。[方法]采用酶解法,对影响原生质体分离的影响因素,设计正交实验,通过显微镜观察计数比较原生质体的分离效果。[结果]在M7和M9的酶液组合对原生质体分离效果最好,产量分别为6... 详细信息

[目的]通过优化限制因素,探索水曲柳原生质体制备的最佳方法。[方法]采用酶解法,对影响原生质体分离的影响因素,设计正交实验,通过显微镜观察计数比较原生质体的分离效果。[结果]在M7和M9的酶液组合对原生质体分离效果最好,产量分别为6.61×105个/g和5.76×105个/g,活力分别为97.57%和97.07%。在11%的渗透压中原生质体产量最高。pH 5.2时产量最高,pH值增加不利于原生质体产量增加。酶解时间对原生质体产量差异显著,虽然14 h产量最高,但6 h、8 h、12 h、14 h之间产量差异不显著。[结论]采用酶解法初步获得了水曲柳原生质体分离的最适条件,在预处理3 h,渗透压为11%,在1.5%纤维素酶+0.8%离析酶+0.4%半纤维素酶中,pH值为5.2,黑暗条件下酶解14h。

关键词：曲柳原生质体细胞活力酶液组合

‘新牧4号’紫花苜蓿原生质体游离和培养因素的研究

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中国农学通报 2017年第1期33卷 137-141页

作者：陈爱萍刘慧敏李瑶冯维卫新疆草地资源与生态实验室/新疆农业大学草业与环境科学学院乌鲁木齐830052

主要探讨影响苜蓿原生质体游离和培养的因素,为原生质体培养体系的建立提供依据。以‘新牧4号’紫花苜蓿的子叶、下胚轴和愈伤组织为材料,研究了酶液的p H值,酶解时间,酶液组合和不同培养方法对原生质体游离和培养效果的影响。结果表明... 详细信息

主要探讨影响苜蓿原生质体游离和培养的因素,为原生质体培养体系的建立提供依据。以‘新牧4号’紫花苜蓿的子叶、下胚轴和愈伤组织为材料,研究了酶液的p H值,酶解时间,酶液组合和不同培养方法对原生质体游离和培养效果的影响。结果表明:当酶液p H 5.8时,有活力的原生质体的产量最高,同时细胞碎片少;子叶、下胚轴和愈伤组织适宜的酶解时间均为10 h;酶液组合为2%纤维素酶+0.5%果胶酶+0.3%或0.5%离析酶,游离出的有活力的原生质体产量较高;采用液体浅层培养和固液双层培养,均观察到原生质体发生分裂,但固液双层培养法更有利于‘新牧4号’紫花苜蓿原生质体的分裂和培养。

关键词： '新牧4号’紫花苜蓿 p H值酶解时间酶液组合培养方法