山丹丹原生质体分离初探

作     者：王珺华 

作者单位：延安大学 

学位级别：硕士

导师姓名：齐向英

授予年度：2020年

学科分类：090706[农学-园林植物与观赏园艺] 0907[农学-林学] 09[农学] 

主      题：山丹丹 原生质体 酶液组合 酶解时间 离心条件 

摘      要：山丹丹(Lilium pumilum DC.)是集观赏、食用和药用功能于一体的百合科百合属植物,因耐寒旱、耐盐碱能力强成为百合属植物育种的优良资源来源,但百合属植物有性杂交育种时存在不亲和性,严重降低山丹丹基因资源的利用效率。原生质体是缺失细胞壁、具有植物全套的遗传基因的活性细胞团,原生质体融合为植物育种提供新的途径,原生质体则为开展植物细胞水平、分子水平上的基础研究提供良好的实验平台,因此开展山丹丹原生质体的研究对于百合属植物优化育种、山丹丹种质资源理论研究均有重要的意义。为获得满足一定数量和活性要求的山丹丹原生质体。本研究以山丹丹鳞片诱导的愈伤组织为试验材料,设计正交试验探究纤维素酶、果胶酶和甘露醇对山丹丹原生质体产量和活性的影响,设计单因素试验探究酶解时间、纯化方式、预处理方式和培养条件对山丹丹原生质体分离和培养的影响,优化了山丹丹原生质体分离条件,进而建立了高效高产的山丹丹原生质体分离体系,为山丹丹的种质资源高效利用和理论研究提供支持和参考,具体工作如下:1.山丹丹原生质体分离最佳酶解时间为6 h,原生质体产量3.46×10个/mL,活性为39.17%。酶解条件为0.015 g/mL纤维素酶浓度,0.005 g/mL果胶酶浓度,0.12 g/mL甘露醇浓度,调节混合酶液pH=5.7,在黑暗条件、25℃和50 rpm震荡速度酶解。2.设计3因素4水平L(3)正交试验研究纤维素酶浓度(0.00 g/mL、0.01 g/mL、0.02 g/mL和0.03 g/mL)、果胶酶浓度(0.002 g/mL、0.004 g/mL、0.006 g/mL和0.008 g/mL)和甘露醇浓度(0.09 g/mL、0.11 g/mL、0.13 g/mL和0.15 g/mL)对山丹丹原生质体产量和活性的影响,正交试验酶解时间分别为3、6和9 h,影响原生质体产量的主次因素均为纤维素酶果胶酶甘露醇,影响原生质体活性的主次因素均为甘露醇纤维素酶果胶酶。对正交试验结果中纤维素酶、果胶酶和甘露醇3个因素在不同水平上的原生质体产量和活性进行显著性分析,得出3 h时正交试验最佳的组合为纤维素酶0.03g/mL+果胶酶0.006 g/mL+甘露醇0.11 g/mL,该条件下的时间成本最小;6 h时正交试验最佳的组合为纤维素酶0.02 g/mL+果胶酶0.006 g/mL+甘露醇0.11g/mL,该条件最有利于原生质体的产量和活性增加;9 h时正交试验最佳的组合为纤维素酶0.01 g/mL+果胶酶0.004 g/mL+甘露醇0.13 g/mL,该条件下药品成本最低。3.山丹丹原生质体分离最佳预处理方式为暗处理,本实验条件下,暗处理能够显著促进原生质体产量和活性的增加,原生质体产量从5.17×10个/mL增加至9.67×10个/mL,原生质体活性从21.21%增加至76.54%。酶解条件为0.02 g/mL纤维素酶+0.008 g/mL果胶酶+0.11 g/mL甘露醇,调节混合酶液pH=5.7,在黑暗条件、25℃和50 rpm震荡速度酶解6 h。4.山丹丹原生质体分离最佳离心条件是800000 r/min离心转速,10 min离心时间,原生质体产量为9.670×10个/mL,活性为33.872.24%,酶解条件为0.02 g/mL纤维素酶+0.008 g/mL果胶酶+0.11 g/mL甘露醇,调节混合酶液pH=5.7,在黑暗条件、25℃和50 rpm震荡速度下酶解6 h。