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褐飞虱细胞色素P450基因CYP6CW1异源表达及其酶学活性初步研究

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褐飞虱细胞色素P450基因CYP6CW1异源表达及其酶学活性初步研究

作者：周露湖北大学

学位级别：硕士

水稻是最重要的粮食作物之一,世界上约有一半以上的人口以稻米为主食。褐飞虱(Nilaparvata lugens Stal. Homoptera:Delphacidae, brown planthopper)是水稻的主要害虫之一。长期以来,人们以化学防治与抗性水稻品种的推广应用相结合的... 详细信息

水稻是最重要的粮食作物之一,世界上约有一半以上的人口以稻米为主食。褐飞虱(Nilaparvata lugens Stal. Homoptera:Delphacidae, brown planthopper)是水稻的主要害虫之一。长期以来,人们以化学防治与抗性水稻品种的推广应用相结合的方法来防治褐飞虱,并取得了一定防治效果。生活中常用的化学杀虫剂可在短期内有效的防治害虫,但易引起环境污染;至于抗性水稻,褐飞虱会产生耐受性而再次猖獗,所以研究褐飞虱与水稻互作的分子机理,可以为寻找有效环保的褐飞虱防治方法提供线索和理论参考。昆虫CYP6家族的细胞色素P450,常被报道在代谢次生物质和适应宿主植物过程中起着重要作用。为了更进一步了解褐飞虱的P450家族的CYP6家族基因的功能,本研究开展了以下工作：1、本研究根据已登录到GenBank数据库中的序列,克隆了褐飞虱细胞色素P450基因CYP6CW1和家蝇NADPH细胞色素P450还原酶(NADPH-Cytochrome P450reductase, NCPR)基因的开放阅读框(ORF),将测序结果正确的基因片段分别连接到供体质粒MH中,将重组供体质粒MH-CYP6CW1和MH-NCPR分别转化到大肠杆菌DH10p中并作为供体菌;通过MAGIC技术(Mating-assisted genetically integrated cloning)分别将两个目的基因同源重组到受体菌株细胞(Ac-phes菌株)中的杆状病毒穿梭载体上,并筛选出阳性重组子;通过脂质体转介导法转染草地贪夜蛾Sf9(Spodoptera frugiperda)细胞分别获得两种阳性重组子P1代重组杆状病毒上清,反复感染新鲜细胞后得到一定滴度的重组杆状病毒并利用Western Blot杂交检测重组CYP6CW1和NCPR蛋白表达情况。2、将构建好的CYP6CW1、NCPR重组杆状病毒粒子和氯高铁血红素(3mg/mL)共同感染Sf9昆虫细胞实现两个重组基因的共表达,并获得CYP6CW1重组酶。将重组酶的细胞破碎液与药物苯巴比妥孵育后,利用高效液相色谱法(High performance liquid charomatography, HPLC)图谱分析重组酶CYP6CW1的酶学活性,结果显示与正常细胞相比,共表达的CYP6CW1重组酶可以代谢分解苯巴比妥从而证明CYP6CW1重组酶有一定的代谢活性。本研究利用目前运用广泛的Bac-to-Bac杆状病毒表达系统和交配辅助遗传整合克隆(MAGIC),将褐飞虱CYP6CW1和家蝇NADPH细胞色素P450还原酶基因成功表达于昆虫Sf9细胞中,并获得具有代谢活性的CYP6CW1重组酶。为揭示褐飞虱与水稻互作的分子机制和寻找新的防治策略奠定了一定的理论基础。

关键词：褐飞虱 CYP6CW1 苯巴比妥异源表达酶学活性

滑液囊支原体NADH氧化酶酶学活性及粘附特性研究

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滑液囊支原体NADH氧化酶酶学活性及粘附特性研究

作者：李浩然安徽农业大学

学位级别：硕士

滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)主要引起鸡和火鸡的亚临床呼吸系统疾病、蛋壳顶端畸形及关节渗出型滑膜炎。研究表明,参与支原体代谢相关的酶类,不仅在胞浆中发挥酶的功能,而且在细胞膜上协助支原体粘附和入侵宿主细胞方面发挥... 详细信息

滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)主要引起鸡和火鸡的亚临床呼吸系统疾病、蛋壳顶端畸形及关节渗出型滑膜炎。研究表明,参与支原体代谢相关的酶类,不仅在胞浆中发挥酶的功能,而且在细胞膜上协助支原体粘附和入侵宿主细胞方面发挥作用。NADH氧化酶(NADH oxidase,NOX)是一种氧化还原酶,本论文对滑液囊支原体的NOX酶学活性及粘附特性进行研究,为进一步探索NOX在MS致病过程中的作用提供了分子基础。首先,构建NOX表达菌株BL21(pET28a-MSnox),IPTG诱导表达后,SDS-PAGE电泳分析重组MSNOX(rMSNOX)蛋白表达于上清中。Beaver Beads TM His Tag磁珠对上清中rMSNOX蛋白纯化后,获得纯化的rMSNOX蛋白。Western blot鉴定rMSNOX蛋白具有反应原性,ELISA检测抗rMSNOX兔多克隆抗体效价达到1:102 400及抗rMSNOX兔多克隆抗体介导的补体杀菌实验显示杀菌率为86.42%。NOX在O存在下能催化NADH氧化为NAD,OD测定NADH转化量以此衡量NADH氧化酶酶学活性。酶活测定显示rMSNOX蛋白的酶比活力为14.17 IU/mg,最适酶促温度为37℃,最适p H为7.5,双倒数法求得rMSNOX的最大反应速率V为21.8μmol/(L·min),米氏常数K(NADH)为244.0μmol/L。其次,通过Western blot及悬浮免疫荧光鉴定rMSNOX蛋白亚细胞定位,结果表明rMSNOX蛋白主要存在于MS胞浆中,MS膜表面也有少量的分布。间接免疫荧光检测rMSNOX蛋白对DF1细胞的粘附作用,同时支原体菌落计数法测定抗rMSNOX兔多克隆抗体对MS粘附DF1细胞的抑制效率。结果显示,rMSNOX蛋白能特异性粘附DF1细胞,同时抗rMSNOX兔多克隆抗体能显著抑制MS对DF1细胞的粘附作用,抑制率达到67.87%,为进一步分析MSNOX蛋白在MS粘附宿主细胞中的作用机制,采用Western blot和ELISA法检测rMSNOX与宿主细胞的胞外基质蛋白cPlg和Fn的结合作用,结果显示rMSNOX与cPlg和Fn均具有结合活性。综上所述,本论文对MS的NOX蛋白进行体外重组表达,证实其不仅具有NADH氧化酶的活性,在MS的细胞膜上也有少量分布,并且发挥着粘附宿主细胞的生物学功能。该研究为进一步探索NOX在MS致病过程中的作用提供了分子基础。

关键词：滑液囊支原体 NADH氧化酶酶学活性粘附特性

饲用微生物酶学活性的测定及其发酵红枣饲料营养品质的研究

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饲用微生物酶学活性的测定及其发酵红枣饲料营养品质的研究

作者：邢晓南西北农林科技大学

学位级别：硕士

本试验将从玉米秸秆中分离得到的枯草芽孢杆菌、植物乳酸杆菌及酿酒酵母菌构建为复合微生物菌剂,通过测定各菌株酶学活性及生长特点,确定最适发酵条件,用于发酵红枣饲料,以提高其营养价值,降低毒素等有害物质含量,改善其饲用品质。试验... 详细信息

本试验将从玉米秸秆中分离得到的枯草芽孢杆菌、植物乳酸杆菌及酿酒酵母菌构建为复合微生物菌剂,通过测定各菌株酶学活性及生长特点,确定最适发酵条件,用于发酵红枣饲料,以提高其营养价值,降低毒素等有害物质含量,改善其饲用品质。试验一发酵红枣饲料复合菌剂酶学活性的测定及最适生长条件的探究本试验通过定性和定量的方法,采用纤维素-刚果红筛选培养基,结合纤维素酶活力及产酸抑菌活性的测定,探究不同温度和p H条件下对枯草芽孢杆菌分泌纤维素酶及木质素酶活力和植物乳酸杆菌产酸抑菌能力的影响,以及各菌株生长曲线的测定,充分掌握各菌株的最适泌酶及产酸条件,并确定最佳生长接种时间。结果表明:稀释涂板后,各菌株种子液活菌数均大于9*10cfu·m;枯草芽孢杆菌、植物乳酸菌及酿酒酵母菌菌株的最适生长及接种时间为培养第20 h;综合研究结果表明枯草芽孢杆菌最适产纤维素酶与木质素酶温度和p H分别为37℃和6.5;乳酸菌最适产酸温度为37℃。试验二复合菌剂固态发酵对红枣饲料营养品质的影响试验以枣粉发酵产品营养成分含量,感官状态,p H,黄曲霉毒素B1,玉米赤霉烯酮为评价指标,设计三个递进式关联式试验。试验一,利用酿酒酵母菌(S2,S11)、植物乳酸杆菌(R7,R9)、枯草芽孢杆菌(B26,B37,C61)组合成复合菌剂为试验优化因素,单菌添加梯度为2%,3%,4%,设计三因素三水平正交试验,探究复合菌剂最佳组方;试验二,以不同菌剂添加量(根据试验一探究结果)、水分含量(20%,30%,40%)、麸皮添加量(20%,30%,40%)为试验优化因素设计三因素三水平的正交试验,探究最佳发酵条件;试验三,以发酵时间为唯一变量为试验因素探究最佳发酵时间。结果表明:1)不同菌剂添加比例对红枣饲料营养物质含量具有不同程度影响,黄酮、多酚、还原糖含量及NDF、ADF降解率Mix4、Mix5、Mix8极显著高于其他组合及对照组(P酶烯酮含量均符合我国饲料卫生生产标准。就本试验条件下,枣粉饲料最优发酵条件为:复合菌剂最佳组方为酿酒酵母:植物乳酸杆菌:枯草芽孢杆菌=2:1:2,复合菌剂添加量为3%,麸皮添加量为20%,接种菌剂前发酵基质含水量为20%,发酵时间为6 d。在该条件下,黄酮含量较原料组提高31.23%,多酚含量较原料组提高17.12%。

关键词：饲用微生物红枣生长条件酶学活性黄酮多酚

金纹细蛾I型几丁质酶的表达、纯化及酶学活性测定

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金纹细蛾I型几丁质酶的表达、纯化及酶学活性测定

作者：仙笑笑太原理工大学

学位级别：硕士

几丁质由N-乙酰氨基葡萄糖残基通过β-1,4糖苷键结合而成的直链多聚物,是昆虫外骨骼、肠道、气管及围食膜等的主要组成成分。昆虫几丁质酶是一种能够将几丁质水解成为寡聚物的内切酶,广泛存在于昆虫的中肠、蜕皮液及某些昆虫的毒腺中,... 详细信息

几丁质由N-乙酰氨基葡萄糖残基通过β-1,4糖苷键结合而成的直链多聚物,是昆虫外骨骼、肠道、气管及围食膜等的主要组成成分。昆虫几丁质酶是一种能够将几丁质水解成为寡聚物的内切酶,广泛存在于昆虫的中肠、蜕皮液及某些昆虫的毒腺中,在昆虫的生长发育过程中精确的调节着几丁质的代谢。目前,昆虫几丁质酶主要应用在病虫害防治、疾病控制及几丁质生物垃圾的降解等方面。本研究首次将金纹细蛾Ⅰ型几丁质酶（LrCHT5）基因分别构建到原核表达载体pRSET-C、pET28a、pET32a及pMAL-s上,进行原核载体的筛选,期望能够获得表达可溶性蛋白的载体。利用分子生物学常规实验方法构建重组载体,将其分别转化到相应的表达感受态中,利用IPTG进行诱导,SDS-PAGE电泳分析结果表明构建的重组BL-pET28a-LrCHT5及BL-pET32a-Lr CHT5表达的蛋白以包涵体形式存在,重组BL-pRSET-LrCHT5没有表达出目的蛋白,重组BL-pMAL-ZrCHT5表达出110kDa左右的可溶性融合蛋白MBP-Lr CHT5。Western blot检测结果进一步证明重组BL-pMAL-LrCHT5菌表达出可溶性融合蛋白。为了使融合蛋白能够高效表达,本研究对重组pMAL-LrCHT5菌液的表达条件进行优化,最佳表达条件最终优化为菌液OD值为0.778,诱导剂IPTG浓度为0.5mmol/L,诱导的过程中采用16℃过夜诱导。对于表达的MBP-LrCHT5蛋白采用4℃与Amylose柱过夜结合进行纯化,SDS-PAGE电泳分析结果显示纯化出纯度较高的MBP-LrCHT5融合蛋白。利用胶状几丁质及4MU-（GlcNAc）3作为底物均未检测到活性。由于重组BL-PMAL-LrCHT5表达的融合蛋白MBP-LrCHT5在纯化的过程中及生物学活性方面存在问题,本研究将LrCHT5基因构建到载体pFastBacTM Dual上,进一步转化入DH10Bac感受态中,获得重组穿梭载体Bacmid-LrCHT5,利用脂质体介导转染Sf9细胞并进行细胞表达。由于LrCHT5本身含有信号肽区,所以在表达的过程中分泌到细胞培养液中。表达结束后,对培养液进行收集透析,利用Ni-NTA柱进行蛋白分离纯化,SDS-PAGE电泳分析结果显示纯化得到单一条带的纯化蛋白。本研究对原核和Sf9细胞表达的目的蛋白进行酶学活性检测。利用4MU-（GlcNAc）3作为底物,结果显示,原核表达的融合蛋白不具酶学活性,Sf9细胞表达的目的蛋白的比活力为2.917U/μg,最佳温度为50℃左右,最佳pH为6.0。高浓度的金属离子Mn2+、Ca2+、Mg2+及Ba2+对LrCHT5蛋白具有不同程度的促进作用,Cu2+对酶有较强的抑制作用,SDS酶的抑制作用最强。通过对LrCHT5蛋白的动力学参数测定结果显示Km为14.2μm/L, Vmax值为0.905μM/min。另外,对纯化的LrCHT5蛋白进行抑菌实验研究,结果表明LrCHT5蛋白对青霉及酵母分别存在不同程度的抑制作用。本课题深入研究了LrCHT5的生化性质,为LrCHT5功能研究奠定了基础,同时为金纹细蛾的生物学防治提供理论依据。

关键词：金纹细蛾 Ⅰ型几丁质酶原核表达系统 Bac-to-Bac杆状病毒表达系统酶学活性

核糖体失活蛋白的酶学活性及生理功能研究进展

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生物学教学 2004年第3期29卷 3-4页

作者：王小娟华东师范大学生命科学学院上海200062

核糖体失活蛋白是一类植物毒蛋白。近年来,这类蛋白的酶学活性及生理功能不断被揭示,本文对其中一些主要的酶学活性及生理功能作了概述。

关键词：核糖体失活蛋白酶学活性生理功能植物毒蛋白

醛酮还原酶AKR7A3原核表达条件的优化及酶学活性检测

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长春理工大学学报（自然科学版） 2018年第5期41卷 137-141页

作者：孙婷婷孙基丰周紫薇褚春旭张昊长春理工大学生命科学技术学院长春130022

AKR7A3属醛酮还原酶是NADPH依赖型的氧化还原酶超家族的一员,参与人体内很多极为重要的生理活动。本文构建原核表达载体,优化表达条件,获得可溶性好、活性高的AKR7A3属醛酮还原酶。研究了温度、转速、诱导时间和IPTG浓度等不同条件对AKR... 详细信息

AKR7A3属醛酮还原酶是NADPH依赖型的氧化还原酶超家族的一员,参与人体内很多极为重要的生理活动。本文构建原核表达载体,优化表达条件,获得可溶性好、活性高的AKR7A3属醛酮还原酶。研究了温度、转速、诱导时间和IPTG浓度等不同条件对AKR7A3酶表达量的影响,并进行了酶活性动力学检测分析。在16℃、110rpm/min、20h、1.00mM/L诱导剂浓度时AKR7A3可溶性蛋白达到99.0%。酶活性动力学检测结果说明在37℃;PH=7.0;NADPH浓度2mmol/L;底物浓度在2.00mmol/L;加酶量100μL时酶活性最好,最佳反应底物为睾丸酮。成功在大肠杆菌中表达出高活性的可溶性酶蛋白,并获得了体外酶活性的最佳动力学条件,为后续AKR7A3基础研究和应用研究提供实验基础。

关键词：醛酮还原酶 AKR7A3 原核表达酶学活性

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牛肠激酶轻链基因的重组表达及其酶活性分析

牛肠激酶轻链基因的重组表达及其酶活性分析

作者：许映冲扬州大学

学位级别：硕士

牛肠激酶轻链(enterokinase light chain,EKL)是一种高度专一性识别Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列的蛋白酶,它能够在Lys的C端水解多肽,在蛋白生产和生物工程领域具有广泛的应用价值。目前市售EKL价格昂贵,提取分离成本较高,且天然的牛肠激酶... 详细信息

牛肠激酶轻链(enterokinase light chain,EKL)是一种高度专一性识别Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列的蛋白酶,它能够在Lys的C端水解多肽,在蛋白生产和生物工程领域具有广泛的应用价值。目前市售EKL价格昂贵,提取分离成本较高,且天然的牛肠激酶来源有限,致使其应用受到限制。基于此,本研究利用基因工程方法,通过体外重组表达及其表达条件的优化,获得了较高产量且具有酶活性的EKL,从而为其开发应用提供了技术支撑。1牛肠激酶轻链基因的原核表达及其酶活性分析通过替换pET-28a(+)载体上的核糖体结合位点来提高EKL蛋白表达量。首次将EKL基因上游的 RBS1 序列(5’-TTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGA-3’)替换成 RBS2 序列(5’-AAAGAGGAGAAA-3’),并构建了重组表达质粒 pET-28a(+)-RBS1-EKL-His 和pET-28a(+)-RBS2-EKL-His。酶切鉴定和测序正确后,将其分别转化感受态E.coli ArcticExpress(DE3)。经 IPTG 诱导,SDS-PAGE 和 Western-blot 结果显示,融合蛋白RBS1-EKL-His和RBS2-EKL-His均主要以包涵体的形式表达,并且RBS2-EKL-His的表达量相对较高。将包涵体进行复性,并通过亲和层析柱纯化结果显示,与RBS1-EKL-His相比,RBS2-EKL-His的蛋白产量提高了 55.20%。酶学活性结果显示,两者均能够特异性切割含有(Asp)4-Lys序列的底物蛋白。综上表明,将RBS1替换为RBS2后,提高了具有酶活性的EKL的表达量。2牛肠激酶轻链基因的真核表达及其酶活性分析根据牛EKL基因序列设计并合成引物,PCR扩增EKL基因,并将其克隆至真核表达载体pPIC9K的相应位点,构建重组表达质粒pPIC9K-His-EKL。酶切鉴定和序列分析正确后,将其转化至组氨酸缺陷型毕赤酵母宿主菌GS115中。经筛选,PCR鉴定结果表明,His-EKL基因成功整合到毕赤酵母的染色体中。通过诱导条件的优化,确定His-EKL在毕赤酵母中表达的最佳发酵条件为:诱导温度30℃,培养基初始pH 5.0,甲醇浓度1%,诱导时间72 h。利用亲和层析柱进行纯化,SDS-PAGE和Western-blot结果显示,融合蛋白His-EKL在毕赤酵母中成功获得分泌性表达,His-EKL纯度为98%,并且具有酶活性。本研究通过在两种蛋白表达系统中获得了 EKL,相较于大肠杆菌原核表达系统,通过优化毕赤酵母发酵条件,可以获得较高表达量和酶活力的分泌型表达产物EKL,更有利于实验室的推广应用,为降低蛋白生产的成本提供了生物原料。

关键词：牛肠激酶轻链核糖体结合位点大肠杆菌毕赤酵母酶学活性发酵

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野猪DHX36解旋酶酶学特性及保守性分析

中国生物化学与分子生物学报 2022年第12期38卷 1681-1693页

作者：徐思颖郭海磊奚绪光西北农林科技大学生命科学学院生物化学与分子生物学教研室陕西杨凌712100

DHX36解旋酶(DEAH-box helicase 36)在生物体内广泛存在,可作为外源核酸传感器广泛参与机体免疫反应,因其对G-四链体具有高度亲和性和解旋活性而备受关注。目前已报道了3个物种DHX36解旋酶的三维结构,但其酶学活性的保守性研究鲜见报道... 详细信息

DHX36解旋酶(DEAH-box helicase 36)在生物体内广泛存在,可作为外源核酸传感器广泛参与机体免疫反应,因其对G-四链体具有高度亲和性和解旋活性而备受关注。目前已报道了3个物种DHX36解旋酶的三维结构,但其酶学活性的保守性研究鲜见报道。本文以哺乳动物野猪(Sus scrofa)DHX36解旋酶(SsDHX36)为研究对象,通过生物化学与生物物理研究技术系统研究了其酶学性质,并对比其与低等无脊椎动物黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)DHX36解旋酶(DmDHX36)的活性,探究DHX36在物种间的功能保守性。本研究通过原核表达系统,分离纯化得到了纯度大于95%的SsDHX36解旋酶;利用荧光偏振和快速停留技术得到SsDHX36的最佳酶学反应条件,发现SsDHX36对G4 DNA具有平行构型的亲和选择性,对富含鸟嘌呤的ssDNA具有结合和解旋的底物偏好性;结合单分子荧光共振能量转移技术对SsDHX36和DmDHX36进行活性比较,发现两者与G4 DNA结合的构型选择性和对富含鸟嘌呤DNA的底物偏好性是保守的。但两者对不同序列长度ssDNA的亲和性差异显著,SsDHX36受序列长度影响较大且亲和力随序列长度的增加而增强,而DmDHX36则完全相反。本文克隆纯化了SsDHX36解旋酶并研究了其酶学活性,着重分析了SsDHX36和DmDHX36的功能保守性,为理解DHX36的保守功能机制,探究基于DHX36与富含鸟嘌呤序列互作的免疫反应酶学活性基础和靶向药物设计提供了理论与实验基础。

关键词：野猪DHX36解旋酶 G-四链体酶学活性底物偏好性功能保守性

桑树4CL基因家族的筛选和Mm4CL2的功能研究

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蚕业科学 2022年第1期48卷 18-24页

作者：侯冲晁楠戴明洁刘利江苏科技大学生物技术学院江苏镇江212100 中国农业科学院蚕业研究所江苏镇江212100

4-香豆酸辅酶A连接酶(4-coumarate:coenzyme A ligase)是苯丙烷类代谢途径中的重要限速酶。在川桑基因组数据库的基础上利用全基因组筛选方法鉴别出6个Mn4CL同源基因,命名为Mn4CL1~Mn4CL6。蛋白质功能域分析发现6个Mn4CL蛋白均包含保守... 详细信息

4-香豆酸辅酶A连接酶(4-coumarate:coenzyme A ligase)是苯丙烷类代谢途径中的重要限速酶。在川桑基因组数据库的基础上利用全基因组筛选方法鉴别出6个Mn4CL同源基因,命名为Mn4CL1~Mn4CL6。蛋白质功能域分析发现6个Mn4CL蛋白均包含保守结构域BoxⅠ和BoxⅡ,都属于ANL酶超家族。系统发生分析表明,Mn4CL1、Mn4CL2、Mn4CL4与已报道的参与木质素生物合成的4CL聚类在一起,属于第Ⅰ类;Mn4CL3属于第Ⅱ类,参与黄酮类化合物的生物合成;Mn4CL5和Mn4CL6属于4CL类似蛋白。以此为基础,从湖桑32号叶片中克隆出一条长为1641 bp的cDNA序列,命名为Mm4CL2,构建重组质粒pET-28a-Mm4CL2并成功诱导表达出Mm4CL2蛋白。初步的酶学活性分析发现Mm4CL2蛋白能够分别催化香豆酸、咖啡酸和阿魏酸形成其相应的肉桂酰CoA,而不能催化芥子酸。本研究初步鉴定出一个桑树4CL基因Mm4CL2,为基因工程定向选育低木质素的桑树品种提供了新的候选基因。

关键词：桑树木质素 4-香豆酸辅酶A连接酶基因家族酶学活性