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乙型肝炎病毒e抗原基因作为酵母双杂交体系结合域载体的构建及表达

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中华实验和临床病毒学杂志 2004年第2期18卷 158-161页

作者：李伯安戚扬舒翠利刘岩陈昊李靖高蓉侯俊程云解放军第三○二医院传染病研究所免疫研究室北京100039

目的　以乙型肝炎病毒e抗原 (HBeAg)全基因为外源片段 ,构建酵母双杂交体系中结合域载体 ,研究其在酵母细胞中的表达 ,排除自身激活作用及毒性作用 ,验证其适用性。方法　根据报道序列设计、合成HBeAg全基因巢式引物 ,取患者血清 ,通过... 详细信息

目的　以乙型肝炎病毒e抗原 (HBeAg)全基因为外源片段 ,构建酵母双杂交体系中结合域载体 ,研究其在酵母细胞中的表达 ,排除自身激活作用及毒性作用 ,验证其适用性。方法　根据报道序列设计、合成HBeAg全基因巢式引物 ,取患者血清 ,通过PCR方法分离HBeAg全基因片段 ,克隆入T载体 ,酶切鉴定及序列测定后 ,克隆入酵母双杂交体系结合域载体pGBKT7,构建pGBKT7 eAg载体。再次酶切鉴定阳性克隆后转入酵母 ,验证毒性作用 ;通过Western blot实验证实外源基因在酵母中的表达 ;并进一步验证自身激活作用。结果　由血清中分离的及 2次酶切鉴定的片段大小分别为 6 5 7bp和 6 39bp ,与预期大小一致 ;序列测定与报道的HBV分离株核酸及氨基酸同源性分别为96 %和 10 0 % ;转人酵母后无毒性及自身激活作用 ;Western blot实验出现阳性与预期大小 (2 4 .3× 10 3)一致的条带。结论　pGBKT7 eAg载体在酵母细胞中表达出融合蛋白 ,进一步验证无自身激活及毒性作用 ,此载体构建成功 ,适用于酵母双杂交体系。

关键词：乙型肝炎病毒e抗原基因表达酵母双杂交体系结合域载体

应用酵母双杂交体系筛选FXR1P相互作用蛋白

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应用酵母双杂交体系筛选FXR1P相互作用蛋白

作者：孙春莉南华大学

学位级别：硕士

目的应用酵母双杂交体系筛选人胎脑cDNA文库中与脆性X智力低下相关蛋白1(FXR1P)相互作用的蛋白质，进而了解FXR1P的功能，推测FXR1P与脆性X综合征发病机制的关系。方法 (1)将FXR1基因亚克隆进酵母双杂交系统中的pGBKT7载体，得到诱饵... 详细信息

目的应用酵母双杂交体系筛选人胎脑cDNA文库中与脆性X智力低下相关蛋白1(FXR1P)相互作用的蛋白质，进而了解FXR1P的功能，推测FXR1P与脆性X综合征发病机制的关系。方法 (1)将FXR1基因亚克隆进酵母双杂交系统中的pGBKT7载体，得到诱饵质粒pGBKT7-FXR1，转化酵母菌AH109，检测融合蛋白对报告基因LacZ的自激活作用及对酵母菌的毒性;(2)转化了诱饵质粒pGBKT7-FXR1的酵母菌AH109与转化了人胎脑cDNA文库质粒的酵母细胞Y187进行交配，利用营养缺陷型培养基和β-半乳糖苷酶滤膜分析交配混合物中报告基因ADE2、HIS3、LacZ的表达，筛选阳性克隆;(3)提取阳性克隆酵母中的质粒DNA，转化大肠杆菌Top10，利用含氨苄抗生素的LB培养基筛选AD-Library质粒转化子，提取AD-Library质粒，进行酶切和归类;(4)AD-Library质粒转化酵母菌Y187，与转化了诱饵质粒pGBKT7-FXR1的酵母菌AH109进行交配，验证蛋白质的相互作用;(5)真阳性克隆的AD-Library质粒测序及同源性分析。结果 (1)酶切和测序鉴定诱饵质粒pGBKT7-FXR1构建成功，转化酵母菌AH109，融合蛋白对报告基因LacZ无自激活作用，且对酵母菌无毒性：(2)通过文库筛选得到77个阳性克隆;(3)AD-Library质粒酶切后归类获得15组不同克隆;(4)再次验证结果仍为阳性的克隆有10个;(5)测序结果生物学信息分析表明，7个为非编码序列，3个为编码序列，分别是骨架黏附因子B(SAFB)、17β-类固醇脱氢酶1(17β-HSD Ⅰ)和Bcl2转录相关因子(BCLAF1)。结论 (1)成功构建了酵母双杂交系统所需的无自激活性且对酵母菌无毒性的诱饵质粒;(2)筛选胎脑cDNA文库得到FXR1P相互作用蛋白SAFB、17β-HSD Ⅰ和BCLAF1;(3)FXR1P可能参与了神经细胞的凋亡和性激素信号传导途径。

关键词：酵母双杂交体系 FXR1P 脆性X综合征蛋白质相互作用

利用酵母双杂交体系筛选拟南芥ABA信号新元件

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深圳大学学报（理工版） 2004年第3期21卷 210-216页

作者：唐玉林 Erwin Grill 深圳大学生命科学学院深圳518060 慕尼黑工业大学生物研究所

酵母双杂交体系是用活体研究蛋白质间相互作用的有效途径.利用这一体系,从拟南芥的一cDNA表达文库中筛选出了与同源框蛋白AtHB6有相互作用的两蛋白质AtHB7和AtGluRS,提示这两个蛋白有可能是脱落酸(ABA)信号传导途径中的新元件.

关键词：酵母双杂交体系拟南芥脱落酸 AtHB6 AtHB7 AtGluRS

用酵母双杂交体系确定病毒特异性蛋白与宿主蛋白的相互作用

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微生物学杂志 2001年第2期21卷 1-2页

作者：金红周正任小田切孝人中国医科大学基础医学院病原生物教研室辽宁沈阳110001 日本金泽医科大学

用B型流行性感冒病毒BM2 蛋白开放阅读框架片段 ,构建酵母双杂交体系中的“饵”载体 ,明确其在酵母细胞中的表达 ,排除自身激活作用 ,并用酵母双杂交法从人cDNA基因库中筛选出与BM2 蛋白相互作用的蛋白。结果表明 :B型流感病毒BM2 蛋白... 详细信息

用B型流行性感冒病毒BM2 蛋白开放阅读框架片段 ,构建酵母双杂交体系中的“饵”载体 ,明确其在酵母细胞中的表达 ,排除自身激活作用 ,并用酵母双杂交法从人cDNA基因库中筛选出与BM2 蛋白相互作用的蛋白。结果表明 :B型流感病毒BM2 蛋白与宿主细胞的某一蛋白有相互作用。应用酵母双杂交体系 ,可以非常有效地从人cDNA基因库中确定与“饵”蛋白相互作用的蛋白基因。

关键词：酵母双杂交体系 BM2蛋白人cDNA基因库病毒蛋白宿主蛋白相互作用

甘蓝SRK的S域酵母双杂交表达载体的构建及其与SCR作用区段的研究

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甘蓝SRK的S域酵母双杂交表达载体的构建及其与SCR作用区段的研究

作者：彭一波西南大学

学位级别：硕士

芸薹属植物自交不亲和性受单一位点的复等位基因控制,此位点被命名为S位点。它决定柱头表面花粉识别的专一性。S受体激酶基因(S-locus receptor kinase, SRK)和S位点糖蛋白基因(S-locus glycoprotein,SLG)是控制芸薹属植物花柱自交不亲... 详细信息

芸薹属植物自交不亲和性受单一位点的复等位基因控制,此位点被命名为S位点。它决定柱头表面花粉识别的专一性。S受体激酶基因(S-locus receptor kinase, SRK)和S位点糖蛋白基因(S-locus glycoprotein,SLG)是控制芸薹属植物花柱自交不亲和性的两个关键因子。SRK是自交不亲和专一性的决定因子,SLG仅是辅助因子,而S位点富半胱氨酸蛋白(S-locus cystein-rich protein,SCR)是SRK激酶的配体分子,并且三基因完全连锁。蛋白质是生命功能的物质基础,揭示蛋白与蛋白间的相互作用,已成为揭示蛋白质组复杂体系与蛋白质功能模式的先导。本实验采用酵母双杂交技术检测甘蓝SRK胞外域不同片段与SCR不同片段蛋白间相互作用。通过PCR扩增甘蓝SRK胞外域不同片段序列及SCR不同片段基因编码序列,扩增的片段分别与质粒载体pGADT7和PGBKT7连接,构建pGADT7-eSRKs和pGBKT7-SCRs系列重组载体。检测转化酵母Y2HGold的钓饵质粒是否具有自激活发生以及重组钓饵蛋白的毒性。将pGBKT7和pGADT7的重组质粒分别转化酵母菌株Y2HGold和Y187检测蛋白间是否具有相互作用,通过SD/-Leu-Trp-His-Ade培养基筛选得到pGBKT7-SCRs和pGADT7-eSRKs的阳性克隆,然后用X-a-Gal显色反应鉴定转化到酵母中的两个重组质粒相互作用。主要研究结果总结如下： 1.不同截短长度的S位点受体激酶胞外域(eSRK)片段的克隆及其结构特征以结球甘蓝B3幼叶的gDNA为模板,采用PCR扩增不同片段长度的eSRKs基因。经1%(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测,eSRKs的目的片段大小均与引物的理论扩增值大小相符。利用分子克隆技术构建酵母双杂交pGADT7-eSRKs表达载体,DNA测序结果分析表明,pGADT7-eSRKs载体中包含有eSRKs片段且插入的eSRKs片段序列与eSRK28序列完全一致。BLAST在线分析结果表明,eSRKB3编码421个氨基酸,包含了SRK蛋白B-Lectin结构域、SLG结构域和PAN-APPLE结构域,是SRK胞外域的全长;eSRKl包含了eSRK序列的三个高变区域,是编码第5位至第427位氨基酸;eSRK2包含了eSRK序列的两个高变区域,编码第139位至第427位氨基酸;eSRK3包含了eSRK序列的两个高变区域,编码第5位至第273位氨基酸;eSRK4包含了eSRK序列的一个高变区域,编码第5位至第140位氨基酸。 2.酵母双杂交重组AD质粒的毒性及自激活检测将pGADT7空载和pGADT7-eSRKs转化Y187,观察得到Y187 [pGADT7]和Y187 [pGADT7-eSRKs]在SD/-Leu平板上生长状态良好,由此表明重组表达质粒pGADT7-eSRKs成功转入酵母细胞Y187且无毒性作用。此外,Y187[pGADT7-eSRKs]在SD/-Leu平板上呈现生长状态良好的白色菌斑;在SD/-Leu/x-a-gal平板上没有明显蓝色克隆出现。由此可说明pGADT7-eSRKs重组载体在酵母细胞中没有激活报告基因MEL1,无自身的转录激活作用发生。 3. SCRs与eSRKs片段间相互作用检测利用生物信息学分析软件autodocktools对eSRKs与SCRs进行相互作用分析,结果表明eSRKs与SCRs在空间能够相互识别形成融合蛋白。试验显示eSRKs与SCRs片段间两两组合的9个试验组均能在DDO平板上出现生长状态良好的菌斑,其中有Y187[pGADT7-eSRKl]xY2HGold[pGBKT7-SCR2和Y187[pGADT7-eSRK4]xY2HGold[pGBKT7-SCR2]2个试验组能在QDO/x/A平板上出现蓝色克隆,激活报告基因AUR1-C、MEL1、ADE2和HIS3的表达。结果显示SRK和SCR具有相互作用,且初步显示其相互作用区域为SRK第一个外显子的第16～421 bp的片段和SCR第1876～2068 bp的片段。

关键词：甘蓝SRK eSRKs基因 SCRs基因 pGADT7载体 pGBKT7载体酵母双杂交体系

肿瘤及胚胎组织特异表达蛋白CEP65相互作用蛋白的筛选与鉴定

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生物化学与生物物理进展 2004年第6期31卷 512-517页

作者：靳更林孙玉宁张建芝马泓孟麟吴健寿成超北京大学临床肿瘤学院北京市肿瘤防治研究所北京100034

CEP6 5蛋白 (cancerandembryoexpressionprotein 6 5 )为肿瘤单克隆抗体 3H11所识别的抗原分子 ,RT PCR及RNA印迹检测表明 ,CEP6 5蛋白表达于肿瘤及胚胎组织 .为了研究CEP6 5在肿瘤发生中的作用机制 ,以CEP6 5为诱饵蛋白 ,通过酵母双杂... 详细信息

CEP6 5蛋白 (cancerandembryoexpressionprotein 6 5 )为肿瘤单克隆抗体 3H11所识别的抗原分子 ,RT PCR及RNA印迹检测表明 ,CEP6 5蛋白表达于肿瘤及胚胎组织 .为了研究CEP6 5在肿瘤发生中的作用机制 ,以CEP6 5为诱饵蛋白 ,通过酵母双杂交体系筛选人胚胎组织cDNA表达文库 .从 5 2× 10 6个克隆中筛选得到 14个阳性克隆 ,并在酵母体系中通过不同方法得到验证 .在此基础上 ,选取在双杂交中作用明显的 5 1号克隆 ,与CEP6 5作GSTpull down实验 ,结果证明 ,CEP6 5与 5 1号阳性克隆蛋白确能相互作用 .生物信息学分析发现 ,CEP6 5与 5 1号阳性克隆蛋白相互作用。

关键词： CEP65 单克隆抗体酵母双杂交体系相互作用

脆性X智力低下蛋白与NDK/Nm23-H2的相互作用

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中国医学科学院学报 2001年第6期23卷 580-584页

作者：楼蓉梅品超贡金英朱宁寇朝辉吴冠芸沈岩中国医学科学院中国协和医科大学基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室北京100005

目的筛选与脆性X智力低下蛋白(FMRP)相互作用的蛋白,为FMRP生理功能的阐释提供新线索。方法以5月龄人胚海马mRNA为模板制备cDNA,重组于DNA激活结构域载体pGAD10,构建酵母双杂交文库,从中筛选与FMRP相互作用的蛋白。应用酵母双杂交体系对... 详细信息

目的筛选与脆性X智力低下蛋白(FMRP)相互作用的蛋白,为FMRP生理功能的阐释提供新线索。方法以5月龄人胚海马mRNA为模板制备cDNA,重组于DNA激活结构域载体pGAD10,构建酵母双杂交文库,从中筛选与FMRP相互作用的蛋白。应用酵母双杂交体系对FMRP的相互作用区域进行定位。结果(1)所构建的5月龄人胚海马cDNA酵母双杂交文库含1×106克隆,插入片段平均长度约1.5kb,有效克隆90%;(2)在该文库中筛选到一个与FMRP相互作用的阳性克隆。序列分析表明:该克隆为人的核苷酸二磷酸激酶亚基B(NDK/Nm23-H2)cDNA;(3)NDK/Nm23-H2与缺少外显子12、14-17的FMRP异构体,以及含FMRP外显子1-12的克隆相互作用,而与FMRP外显子1-6、外显子2-7不能直接结合。结论人Nm23-H2在酵母细胞内能与FMRP结合,其相互作用区域定位于FMRP的前1-11个外显子。Nm23-H2具反式调控因子特性,FMRP与Nm23-H2的相互作用提示FMRP参与基因表达调控。这一发现有助于进一步研究FMRP在细胞核内的生物学功能。

关键词：酵母双杂交体系脆性X智力低下蛋白人胚海马文库脆性X综合征遗传性疾病

人胎脑中hSNF5结合蛋白的筛选、克隆及分析

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中国医学科学院学报 2004年第5期26卷 529-532页

作者：张怡杨珺吴宁华沈珝琲中国医学科学院中国协和医科大学基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室北京100005

目的寻找在神经细胞中与染色质重塑复合物中hSNF5亚单位相结合的靶蛋白并探索其功能,为阐明hSNF5在细胞中参与染色质重塑复合物对靶基因调控的机制提供线索。方法以hSNF5为诱饵,采用酵母双杂交系统筛选人胎脑MATCHMAKERcDNA文库。测定... 详细信息

目的寻找在神经细胞中与染色质重塑复合物中hSNF5亚单位相结合的靶蛋白并探索其功能,为阐明hSNF5在细胞中参与染色质重塑复合物对靶基因调控的机制提供线索。方法以hSNF5为诱饵,采用酵母双杂交系统筛选人胎脑MATCHMAKERcDNA文库。测定核苷酸序列,计算机软件分析核苷酸的同源性及功能结构域。结果获得9个阳性克隆。DNA序列分析及同源性比较表明,1个克隆的序列与推导蛋白FLJ20643羧基端的mRNA同源性高达97%,4个克隆与GenBank中可编码蛋白的序列有较高的同源性,其他4个克隆编码的氨基酸顺序与GenBank中的已知序列无同源性。结论在人胎脑cDNA文库中克隆到hSNF5的结合蛋白,这些蛋白质可能通过hSNF5募集染色质重塑复合物以调节其靶基因的转录活性熏及其参与的细胞功能。

关键词： hSNF5 酵母双杂交体系基因调控

甘蓝SRK的S域及SCR酵母表达载体的构建及其相互作用区段的研究

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园艺学报 2011年第8期38卷 1479-1488页

作者：彭一波朱利泉杨红薛丽琰罗兵吴志刚黄丹杨昆高启国李成琼任雪松王小佳西南大学农学与生物科技学院重庆400716 重庆市蔬菜学重点实验室重庆400716

为了深入研究S位点受体激酶（SRK）和S位点富含半胱氨酸蛋白（SCR）甘蓝自交不亲和（self-incompatibility,SI）信号传导的雌雄决定因子的相互作用机制,以自交不亲和性高的结球甘蓝为材料,采用酵母双杂交体系,构建pGADT7-eSRKs和pGBKT7-... 详细信息

为了深入研究S位点受体激酶（SRK）和S位点富含半胱氨酸蛋白（SCR）甘蓝自交不亲和（self-incompatibility,SI）信号传导的雌雄决定因子的相互作用机制,以自交不亲和性高的结球甘蓝为材料,采用酵母双杂交体系,构建pGADT7-eSRKs和pGBKT7-SCRs重组载体,并分别转化到Y187和Y2HGold酵母中,通过SD/-Ade-His-Trp-Leu平板上菌落的形成,PCR以及x-α-gal显色反应鉴定转化到酵母中的两个重组质粒相互作用。结果表明,SRK S域的SRK1及SRK4分别与SCR2相互作用,且初步显示其相互作用区域为SRK第1个外显子的第16~421bp的片段和SCR第1876~2068bp的片段。这既为SRK-SCR相互作用提供了具体证据,也为甘蓝自交不亲和性分子机理的深入研究提供了新内容。

关键词：甘蓝 SRK eSRKs基因 SCRs基因 pGADT7载体 pGBKT7载体酵母双杂交体系