应用酵母双杂交体系筛选FXR1P相互作用蛋白

作     者：孙春莉 

作者单位：南华大学 

学位级别：硕士

导师姓名：何淑雅

授予年度：2006年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：酵母双杂交体系 FXR1P 脆性X综合征 蛋白质相互作用 

摘      要：目的 应用酵母双杂交体系筛选人胎脑cDNA文库中与脆性X智力低下相关蛋白1(FXR1P)相互作用的蛋白质，进而了解FXR1P的功能，推测FXR1P与脆性X综合征发病机制的关系。 方法 (1)将FXR1基因亚克隆进酵母双杂交系统中的pGBKT7载体，得到诱饵质粒pGBKT7-FXR1，转化酵母菌AH109，检测融合蛋白对报告基因LacZ的自激活作用及对酵母菌的毒性;(2)转化了诱饵质粒pGBKT7-FXR1的酵母菌AH109与转化了人胎脑cDNA文库质粒的酵母细胞Y187进行交配，利用营养缺陷型培养基和β-半乳糖苷酶滤膜分析交配混合物中报告基因ADE2、HIS3、LacZ的表达，筛选阳性克隆;(3)提取阳性克隆酵母中的质粒DNA，转化大肠杆菌Top10，利用含氨苄抗生素的LB培养基筛选AD-Library质粒转化子，提取AD-Library质粒，进行酶切和归类;(4)AD-Library质粒转化酵母菌Y187，与转化了诱饵质粒pGBKT7-FXR1的酵母菌AH109进行交配，验证蛋白质的相互作用;(5)真阳性克隆的AD-Library质粒测序及同源性分析。 结果 (1)酶切和测序鉴定诱饵质粒pGBKT7-FXR1构建成功，转化酵母菌AH109，融合蛋白对报告基因LacZ无自激活作用，且对酵母菌无毒性：(2)通过文库筛选得到77个阳性克隆;(3)AD-Library质粒酶切后归类获得15组不同克隆;(4)再次验证结果仍为阳性的克隆有10个;(5)测序结果生物学信息分析表明，7个为非编码序列，3个为编码序列，分别是骨架黏附因子B(SAFB)、17β-类固醇脱氢酶1(17β-HSD Ⅰ)和Bcl2转录相关因子(BCLAF1)。 结论 (1)成功构建了酵母双杂交系统所需的无自激活性且对酵母菌无毒性的诱饵质粒;(2)筛选胎脑cDNA文库得到FXR1P相互作用蛋白SAFB、17β-HSD Ⅰ和BCLAF1;(3)FXR1P可能参与了神经细胞的凋亡和性激素信号传导途径。