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生物素连接酶BirA及其突变体在病原与宿主互作研究中的应用进展

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生物工程学报 2024年第7期40卷 1981-1996页

作者：张含煜李鹏飞廖浙屿张梦佳孙玉梅张敏何启盖李文涛农业微生物资源发掘与利用全国重点实验室湖北武汉430070 华中农业大学动物医学院湖北武汉430070 农业农村部兽用诊断制剂创制重点实验室湖北武汉430070 湖北洪山实验室湖北武汉430070 宜昌市畜牧兽医中心湖北宜昌443000

蛋白质是机体进行生命活动的主要承担者,研究蛋白质的亚细胞定位及蛋白质之间的相互作用对了解蛋白质功能、阐述机体内分子机制至关重要。邻近标记技术是最新发展的能够在活细胞中检测蛋白质相互作用的有效方法之一。相较于传统研究蛋... 详细信息

蛋白质是机体进行生命活动的主要承担者,研究蛋白质的亚细胞定位及蛋白质之间的相互作用对了解蛋白质功能、阐述机体内分子机制至关重要。邻近标记技术是最新发展的能够在活细胞中检测蛋白质相互作用的有效方法之一。相较于传统研究蛋白质相互作用的方法,邻近标记技术具有灵敏度高、特异性强和背景低等优势,被广泛应用于病原与宿主间蛋白质的相互作用研究中。本文对近些年生物素连接酶BirA及其突变体的发展和应用进行了综述,阐述了几种经典生物素连接酶的作用原理,以期进一步明确基于BirA及其突变体的邻近标记技术在病原-宿主间蛋白质相互作用鉴定中的重要作用。

关键词：蛋白质相互作用邻近标记 BirA 生物素

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邻近标记方法表征细胞-细胞相互作用

高等学校化学学报 2020年第12期41卷 2658-2666页

作者：马维绎刘士博陈鹏北京大学元培学院北京100871 北京大学化学与分子工程学院北京100871

细胞-细胞相互作用在多种生理过程中有重要意义,针对这些相互作用的研究是化学与生命科学交叉领域的前沿热点.基于对酶的功能改造、定向进化和精准的时空调控,酶介导的邻近标记方法在分析细胞-细胞相互作用方面具有广泛的应用前景.本文... 详细信息

细胞-细胞相互作用在多种生理过程中有重要意义,针对这些相互作用的研究是化学与生命科学交叉领域的前沿热点.基于对酶的功能改造、定向进化和精准的时空调控,酶介导的邻近标记方法在分析细胞-细胞相互作用方面具有广泛的应用前景.本文重点描述了现有邻近标记方法的原理、效果、优缺点及潜在应用.

关键词：邻近标记细胞-细胞相互作用时空分辨率

APEX/APEX2邻近标记方法在膜蛋白研究中的应用

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中国细胞生物学学报 2023年第2期45卷 309-316页

作者：刘云臧奕李佳中国药科大学南京210009 中国科学院上海药物研究所上海201203

膜蛋白(membrane proteins,MPs)参与人体内各种复杂的生命活动,了解MPs的结构、功能以及它们的相互作用网络是揭示相关蛋白如何参与复杂的生物学过程的前提。随着蛋白结构预测、结构解析等方面的一系列技术的不断发展,结构获得破解的MP... 详细信息

膜蛋白(membrane proteins,MPs)参与人体内各种复杂的生命活动,了解MPs的结构、功能以及它们的相互作用网络是揭示相关蛋白如何参与复杂的生物学过程的前提。随着蛋白结构预测、结构解析等方面的一系列技术的不断发展,结构获得破解的MPs的数量一直在稳步增加,但是,关于MPs结构和功能的信息仍然非常稀缺。近年来,基于工程抗坏血酸过氧化物酶(engineered ascorbate peroxidase,APEX/APEX2)的邻近蛋白标记技术被广泛应用于探索MPs的亚细胞定位、解析MPs的拓扑结构,追踪MPs的动态迁移过程,以及寻找MPs的相互作用蛋白,该方法为空间受限的MPs的系统分析提供了一种高通量的方法。该综述归纳总结了APEX/APEX2依赖的邻近标记方法在MPs研究中的应用,为MPs的深入研究提供了方法和技术参考。

关键词：膜蛋白 APEX/APEX2 邻近标记亚细胞定位拓扑结构蛋白–蛋白相互作用

通过邻近标记技术探究果蝇Neurexin的相互作用分子

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通过邻近标记技术探究果蝇Neurexin的相互作用分子

作者：吴多琳东南大学

学位级别：硕士

Neurexin（Nrx）是位于突触前的跨膜粘附分子，独特的结构使其能与突触前后的多个分子相互作用，形成跨膜复合体，并促进突触组装和信号传递。研究证实Nrx及其配体与神经系统疾病有关，包括孤独症和精神分裂症等。因此Nrx配体的鉴定对... 详细信息

Neurexin（Nrx）是位于突触前的跨膜粘附分子，独特的结构使其能与突触前后的多个分子相互作用，形成跨膜复合体，并促进突触组装和信号传递。研究证实Nrx及其配体与神经系统疾病有关，包括孤独症和精神分裂症等。因此Nrx配体的鉴定对于理解Nrx相关的神经系统疾病具有指导意义。　　基于过氧化物酶的邻近标记方法（APEX2）是一种能够在活细胞中标记蛋白质，用于检测蛋白质相互作用的技术。该方法通过基因编码将APEX2与目标蛋白融合表达，可以实现对瞬时或者亲和性相互作用蛋白的直接捕获。APEX2具有催化效率快，灵敏度高等优势，已成功应用于小鼠、果蝇等多种模式生物。　　本研究利用APEX2与突触分子Nrx在果蝇神经系统中融合表达，结合质谱和生物信息学分析，以此鉴定与Nrx相互作用的分子。首先，我们构建了HA-APEX2::Nrx，Nrx::HA-APEX2和HA-APEX2的转基因果蝇，从基因组、免疫染色、Westernblot多个手段验证转基因果蝇制备成功。APEX2Nrx可定位于神经肌肉接头（NMJ）的细胞膜，突触小结Bouton的数量与WildType没有显著差异，表明APEX2不干扰Nrx的功能。质谱检测发现，HA-APEX2::Nrx和Nrx::HA-APEX2分别鉴定到145和222个蛋白，对照组HA-APEX2检测到152个蛋白。选取FoldChange≥2或≤1/2为差异蛋白。GO富集分析显示，HA-APEX2::Nrx的差异蛋白主要参与细胞器组织、细胞发育等生物学过程，与蛋白结合、突触前的活动区相关;Nrx::HA-APEX2的差异蛋白主要是膜蛋白、细胞连接分子和突触分子，与突触前活性区、蛋白结合和信号转导等有关。KEGG信号通路分析结果显示APEX2Nrx标记的分子参与代谢通路、遗传信息处理和环境信号过程等通路。　　本研究结合邻近标记酶APEX2，亲和纯化质谱（AP-MS）和生物信息学等方法，以果蝇为模式生物，在体筛选Nrx在神经系统中的相互作用分子。本研究成功创建Nrx时空相互作用蛋白质组，解析了Nrx可能参与的信号转导通路和生物学事件，希望为Nrx相关的神经系统疾病的治疗提供新的靶点和思路。

关键词：神经系统疾病 Neurexin 邻近标记过氧化物酶突触分子

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邻近标记在蛋白质组学中的发展及应用

中国生物化学与分子生物学报 2020年第1期36卷 36-41页

作者：苏田韩笑刘华东西安交通大学生命学院线粒体生物医学研究所

人体内各种复杂的生命活动离不开蛋白质之间的相互作用。这种相互作用具有瞬时性和结合力弱等特点,并受到多种动态调节,特别是蛋白质翻译后修饰(post-translation modifications,PTM)。传统的亲和质谱检测方法存在蛋白纯化的局限性,在... 详细信息

人体内各种复杂的生命活动离不开蛋白质之间的相互作用。这种相互作用具有瞬时性和结合力弱等特点,并受到多种动态调节,特别是蛋白质翻译后修饰(post-translation modifications,PTM)。传统的亲和质谱检测方法存在蛋白纯化的局限性,在高效检测到动态变化方面存在不足。邻近标记是一种能够给与靶蛋白质瞬时靠近,或者互作(邻近)的蛋白质加上生物素的技术,它与质谱检测技术的联合使用能检测细胞过程中弱的、瞬时的蛋白质相互作用,有效解决上述问题。本文综述了基于生物素的邻近标记方法的发展现状,从依赖于融合序列的生物素标记开始,依次介绍有关生物素连接酶、过氧化物酶及其进化后的2代标记方法等经典生物素标记的方法和原理,比较各个方法间的差异和优缺点;也列举了一些近年来新出现的标记方法,如将生物素连接酶进行拆分、鉴定蛋白质在不同复合物中功能的方法、抗体靶向的标记方法,以及其他来源的生物素连接酶突变体,例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的C端氨基酸突变的生物素连接酶,能够应用在苍蝇和蠕虫中的生物素连接酶突变体。本文对这些方法进行归纳总结,旨在为初步接触该领域的科研工作者提供参考,同时也希望能够提供一些新的思路,推动蛋白质相互作用组学的发展。

关键词：蛋白质之间的相互作用邻近标记蛋白质翻译后修饰生物素标记

基于抗坏血酸过氧化酶的电镜成像和活细胞邻近标记方法的应用进展

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生物化学与生物物理进展 2018年第5期45卷 519-528页

作者：徐晓君朱新宇张蕊薛艳红李真珍宋婀莉侯俊杰华中科技大学生命科学与技术学院武汉430074 中国科学院生物物理研究所生物大分子国家重点实验室北京100101 郑州大学第一附属医院肾内科郑州450052

Alice Ting实验室开发的抗坏血酸过氧化物酶(engineered ascorbate peroxidase,APEX),相对于经典的辣根过氧化物酶(horse radish peroxidase,HRP),其酶活性不再受细胞内蛋白质定位的影响,可以在几乎所有的亚细胞区域保持活性,这使其在... 详细信息

Alice Ting实验室开发的抗坏血酸过氧化物酶(engineered ascorbate peroxidase,APEX),相对于经典的辣根过氧化物酶(horse radish peroxidase,HRP),其酶活性不再受细胞内蛋白质定位的影响,可以在几乎所有的亚细胞区域保持活性,这使其在研究亚细胞尺度以及活细胞水平生物学问题时极具优势.目前,基于APEX的二氨基联苯胺(diaminobenzidine,DAB)染色标记技术已经成功地实现对全细胞、亚细胞器和蛋白质水平的电镜成像.同时,与质谱技术结合,基于APEX的活细胞生物素邻近标记方法也极大地推动了亚细胞器蛋白质组学,以及目标蛋白在特定时空条件下邻近蛋白质组学的研究发展.本文将从以上两个方面阐述APEX技术的基本原理及最新应用进展,并讨论和展望其在实际应用中存在的局限性和挑战.

关键词：抗坏血酸过氧化物酶二氨基联苯胺染色标记电镜邻近标记蛋白质组蛋白质相互作用

活细胞内亚细胞结构蛋白质组学研究新技术——几种邻近标记策略的应用及比较

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生物化学与生物物理进展 2019年第7期46卷 641-653页

作者：杜阳春唐菁兰王友军张晓嫣北京师范大学生命科学学院细胞所细胞增殖及调控生物学教育部重点实验室北京100875 北京师范大学生命科学学院遗传与发育生物所抗性基因资源与分子发育北京市重点实验室北京100875 清华大学附属中学国际部北京100084

真核细胞内多种无膜及有膜细胞器为各种生物学过程的发生提供场所.被膜细胞器通过它们之间的膜接触位点所进行的信息交流和物质交换是维持生命活动所必需的.绘制活细胞中细胞器或膜接触位点等处的蛋白质组图谱,将有助于解析这些部位的... 详细信息

真核细胞内多种无膜及有膜细胞器为各种生物学过程的发生提供场所.被膜细胞器通过它们之间的膜接触位点所进行的信息交流和物质交换是维持生命活动所必需的.绘制活细胞中细胞器或膜接触位点等处的蛋白质组图谱,将有助于解析这些部位的生物学功能及作用机制,并为研究细胞器相互作用提供基础.但由于无膜细胞器或膜接触位点很难分离纯化,传统的生化方法难以系统解析其中的蛋白质组.最近报道的几种基于酶类的蛋白质邻近标记技术,则为系统分析上述空间受限的蛋白质组这一难题提供了有效的解决方案.通过将能催化产生活性自由基(最常见的是生物素及其衍生物的自由基)的酶连接到目标蛋白上,可对其邻近的蛋白质组进行共价标记,从而使后者的分离和鉴定成为可能,并可以运用于活细胞中的动态标记.我们在此综述了几种最新的邻近标记策略的原理及应用,并对它们的优势与局限性进行了比较,以期为细胞器互作的蛋白质组学研究提供参考.

关键词：细胞器蛋白质组膜接触位点亚细胞区室蛋白质相互作用邻近标记 BirA APEX BioID TurboID

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邻近标记技术在核酸—蛋白互作中的研究进展

基因组学与应用生物学 2021年第9期40卷 3124-3130页

作者：陈雅婷卢向阳肖桂青湖南农业大学生物科学技术学院长沙410128

邻近标记是通过在已知蛋白上融合1个具有邻近标记功能的酶,在该酶介导的共价修饰下,使其互作的目标蛋白被标记上生物素。该技术可实现在活细胞内对实时、动态的互作蛋白进行精准鉴定,因其独特的优势已成为传统研究方法的有力补充。目前... 详细信息

邻近标记是通过在已知蛋白上融合1个具有邻近标记功能的酶,在该酶介导的共价修饰下,使其互作的目标蛋白被标记上生物素。该技术可实现在活细胞内对实时、动态的互作蛋白进行精准鉴定,因其独特的优势已成为传统研究方法的有力补充。目前该技术已成功应用于瞬时或较弱的蛋白—蛋白互作研究中。本文综述了两类经典的标记技术即基于依赖生物素连接酶BioID邻近标记和依赖抗坏血酸过氧化物酶APEX邻近标记的原理及发展过程,并分析和比较不同邻近标记技术的优缺点;同时对该技术在DNA-蛋白质互作以及RNA-蛋白质互作中的最新研究进展进行概述,以期为进一步明确邻近标记技术在目标大分子复合物成分鉴定中的重要作用提供依据。

关键词：邻近标记 BioID APEX 核酸—蛋白互作

基于TurboID的植物蛋白邻近标记实验方法

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植物学报 2021年第5期56卷 584-593页

作者：邝嘉怡李洪清沈文锦高彩吉华南师范大学生命科学学院广东省植物发育生物工程重点实验室广州510631

邻近标记作为近些年发展起来的一项检测活细胞内蛋白互作关系和亚细胞结构蛋白组的新型技术,已成功应用于多种动植物体系的研究。该技术通过给诱饵蛋白融合一个具有特定催化连接活性的酶,在酶的催化作用下将小分子底物(如生物素)共价连... 详细信息

邻近标记作为近些年发展起来的一项检测活细胞内蛋白互作关系和亚细胞结构蛋白组的新型技术,已成功应用于多种动植物体系的研究。该技术通过给诱饵蛋白融合一个具有特定催化连接活性的酶,在酶的催化作用下将小分子底物(如生物素)共价连接到酶邻近的内源蛋白,通过富集和分析被标记的蛋白可获得与诱饵互作的蛋白组。经定向进化产生的生物素连接酶TurboID具有无蛋白毒性及催化效率高的优势。利用TurboID介导的邻近标记技术分析感兴趣蛋白的邻近蛋白组,可研究细胞内瞬时发生或微弱的蛋白互作网络,进而解析复杂的生物学过程。该文详细描述了在拟南芥(Arabidopsisthaliana)中基于TurboID的邻近标记实验方法及注意事项,旨在为利用这一新技术研究植物蛋白互作关系提供参考。

关键词： TurboID 邻近标记生物素蛋白互作