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小麦体细胞杂交渐渗引起的遗传变异及小麦发育相关基因TaHTD的功能研究

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小麦体细胞杂交渐渗引起的遗传变异及小麦发育相关基因TaHTD的功...

作者：孔丽娜山东大学

学位级别：硕士

小麦是世界上重要的粮食作物之一,因此小麦育种改良对于粮食的增产是十分重要的。本实验室利用不对称体细胞杂交技术,已经获得了多种具有不同表型的小麦渐渗系后代。本实验对多种杂交渐渗系中部分同源基因的表达变异,DNA甲基化修饰的变... 详细信息

小麦是世界上重要的粮食作物之一,因此小麦育种改良对于粮食的增产是十分重要的。本实验室利用不对称体细胞杂交技术,已经获得了多种具有不同表型的小麦渐渗系后代。本实验对多种杂交渐渗系中部分同源基因的表达变异,DNA甲基化修饰的变异以及逆转录转座子的改变等情况进行了深入分析。利用SSCP技术比较分析了济南177和各渐渗系中部分基因的表达情况,发现在检测的80对引物中,有11对引物在渐渗系和亲本小麦中存在基因表达差异。通过MSAP分析所检测的210个亲本JN177特异CCGG位点中,与JN 177相比,在6个体细胞杂种渐渗系中出现高甲基化变异的位点所占比例为10.5%,而出现去甲基化变异的位点所占比例为13.1%;我们通过重亚硫酸盐测序技术对MSAP检测到的4个变异位点所在的DNA片段进行了胞嘧啶甲基化修饰状态的具体分析。REMAP/IRAP分析发现在被检测的219个位点中,与亲本济南177相比,6个体细胞杂种渐渗系中3.2%的逆转录转座子相关序列发生消减,同时有3.3%新条带的出现。利用MSTD技术比较分析了亲本济南177及各杂种渐渗系中Veju和BARE-1两种高拷贝逆转录转座子侧翼序列的DNA甲基化修饰状态,发现与亲本济南177相比,在杂种渐渗系中两种逆转录转座子的35%-40%侧翼序列上出现DNA甲基化变异。以上实验结果为进一步研究渐渗系的不同表型及性状与非对称杂交引起的遗传与表观遗传变异之间的关系奠定了理论基础。利用实验室已有的济南177和山融3号盐胁迫转录组数据,克隆了一个差异表达基因TaHTD,并对其进行了基因功能的初步研究。该基因编码区全长为678碱基,编码一个含225个氨基酸的锌指类转录因子。体外转录激活活性分析表明该基因编码的蛋白具有转录激活活性,亚细胞定位结果表明该蛋白在细胞核、细胞质中普遍存在。为了研究TaHTD基因在植物体内所发挥的功能,我们将其在拟南芥中进行了异源过量表达,发现转基因拟南芥植株的株高明显低于野生型且分枝数明显多于野生型,表明TaHTD基因可以显著影响转基因拟南芥的生长发育。通过qRT-PCR检测了转基因拟南芥与野生型拟南芥中与分枝相关Marker基因表达量情况,发现与野生型Col-0相比,过表达株系中与独脚金内酯相关的AtMAX3、AtMAX4、AtBESl均表达上调,而AtMAX1、AtBRC1、AtD27均表达下调。因此推测,TaHTD转基因拟南芥分枝数的明显增多可能是通过影响独脚金内酯信号通路来实现的。另外,通过NaCl、PEG胁迫条件下小麦中TaHTD基因的表达模式分析结果,可推测TaHTD可能参与到NaCl和PEG的非生物胁迫响应途径中。以上实验结果可以为小麦植株形态的定向改良提供理论基础,并且可以为了解逆境响应和株型发育之间的联系提供机会。

关键词：小麦非对称体细胞杂交逆转录转座子基因表达变异 TaHTD

P53蛋白对LINE-1反转座作用的调控机制的研究

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P53蛋白对LINE-1反转座作用的调控机制的研究

作者：许继伟天津大学

学位级别：硕士

逆转录转座子LINE-1是一类可在基因组中自主移动的元件。人类基因组25%以上的序列由LINE-1直接转座或由LINE-1逆转录酶辅助其它非自主性逆转座子转座而产生,因此认为LINE-1是人类基因组中的主导转座子。研究者已证实,LINE-1可造成DN A... 详细信息

逆转录转座子LINE-1是一类可在基因组中自主移动的元件。人类基因组25%以上的序列由LINE-1直接转座或由LINE-1逆转录酶辅助其它非自主性逆转座子转座而产生,因此认为LINE-1是人类基因组中的主导转座子。研究者已证实,LINE-1可造成DN A双链断裂,引起基因组的不稳定,改变其它基因的正常表达,LINE-1在基因组中的逆转座还能导致多种疾病的发生。哺乳动物细胞已经进化出一系列的防御机制用来调控逆转录转座子在基因组中的转座。P53基因是人体最重要的肿瘤抑制基因之一。P53基因突变与多种肿瘤相关。P53基因已经被证实可以调控LINE-1的逆转座活性。研究显示小鼠和人中P53基因突变可导致体内反转座水平大幅升高。P53蛋白调控LINE-1逆转座的具体机制还不清楚。研究表明SAMHD1和APOBECs等因子通过调控LINE-1的ORF1蛋白和ORF2蛋白的功能进而发挥抑制作用。本研究探讨了P53蛋白与LINE-1 RNP的结合能力及对ORF2p逆转录酶活性的影响,并进一步验证了p53基因突变后丧失了抑制机体逆转座的作用。我们的研究结果提示:P53蛋白能够明显地抑制LINE-1逆转座活性,常见的在p53 DNA结合域的单点突变丧失了对LINE-1逆转座活性的抑制作用。P53蛋白与LINE-1 RNP具有结合作用,但不是通过与ORF1p蛋白和LINE-1 RNA直接结合而发挥作用。通过LEAP实验,我们发现P53蛋白可以选择性地靶向LINE-1 RNP进而实现对LINE-1 ORF2p逆转录酶活性的抑制。某些P53 DNA结合域的单点突变(P53 R175H)会丧失了抑制ORF2p逆转录酶活性的能力,而P53 R273H则还具有抑制ORF2p逆转录酶活性的能力。这说明P53蛋白抑制逆转录转座子LINE-1存在多种机制,还需进一步探讨。同时,我们在结肠癌细胞系HCT116中发现在P53基因缺失后,LINE-1的RNA表达水平有明显的提升。而HCT116 wt P53的细胞中LINE-1的RNA表达水平则相对下降,我们认为P53蛋白能够抑制内源LINE-1mRNA的表达。本研究对全面理解P53蛋白调控逆转录元件提供了一定的实验依据,为探索治疗由人体自身的逆转录转座子导致的疾病提供了潜在的新思路。

关键词： LINE-1 逆转录转座子 P53

苹果IRAP体系的建立及苹果芽变无性系的鉴定

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苹果IRAP体系的建立及苹果芽变无性系的鉴定

作者：周军永安徽农业大学

学位级别：硕士

苹果（Malus domestica Borka）是世界范围内一种重要的果树之一,在长期进化过程中形成了丰富的遗传多样性。本研究以苹果属元帅系和富士系芽变品种为试材,建立了苹果属植物逆转录转座子间扩增多态性（Inter-retrotransposon amplified ... 详细信息

苹果（Malus domestica Borka）是世界范围内一种重要的果树之一,在长期进化过程中形成了丰富的遗传多样性。本研究以苹果属元帅系和富士系芽变品种为试材,建立了苹果属植物逆转录转座子间扩增多态性（Inter-retrotransposon amplified polymo- rphism,IRAP）技术体系,利用此体系构建了元帅系和富士系芽变品种的指纹图谱,进行了苹果芽变无性系的鉴定。利用ARL5引物在芽变品种‘玫瑰红’中发现了一条特异片段,根据对此片段分析结果,设计1对引物,成功将IRAP标记转化为特征性片段扩增区域（Sequence characterized amplified region,SCAR）标记;利用反向PCR（Inverse PCR,IPCR）技术克隆了其侧翼的未知序列,为进一步探明苹果芽变机理和基因功能奠定技术基础。1、利用已获得的苹果Ty1-copia类逆转座子LTRs建立了苹果IRAP技术体系,对影响IRAP-PCR扩增结果的若干因子进行了研究。优化的体系包含:25μL反应体系中,10×buffer 2.5μL、模板DNA 50 ng、Mg 2.5 mmo1-L、dNTPs 0.2 mmo1-L、引物0.4μmo1-L、TaqDNA聚合酶1 U;优化的PCR扩增程序为:94℃2 min,94℃l min,退火1 min,72℃2 min,循环35次;72℃延伸10 min;退火温度根据引物温度设定。试验证明利用该体系在供试芽变品种中获得了较为理想的扩增结果。2、利用自己开发的IRAP引物对15个元帅无性系芽变和16个富士无性系芽变进行了鉴定。所有引物在两类无性系芽变中均扩增出丰富的条带,且表现出多态性。以相似系数0.76为标准,供试的15个元帅无性系变异经SAHN聚类可聚为4类:第一类包括‘元帅’、‘居家店短红星’、‘艳红’、‘米勒矮生’、‘矮壮’、‘红星’、‘红冠’、‘矮威尔’、‘早红星’和‘华帅一号’;第二类包括‘玫瑰红’、‘奥勒冈矮生’和‘矮红’;‘新红星’和‘哈蒂.勃莱特’分别独自成类。以相似系数0.74为标准,供试的16个富士芽变无性系可聚为5类,第一类包括‘长富3’、‘盛放富1’、‘长富6’、‘群富1’、‘烟富1’、‘竽井Ⅱ系’、‘岩手Ⅰ系’、‘富士Ⅰ系’、‘红王将’和‘长富7’;第二类包括‘富士’和‘秋富5’;第三类包括‘秋富1’和‘秋富2’;‘长野Ⅰ系’和‘斋藤Ⅱ系’分别独自成类。本研究结果表明逆转座子在苹果基因组内的插入方向具有随意性,转座插入和逆转座子间重组是引起苹果无性系变异的两个重要机制,本试验所开发的引物是进行苹果无性系变异研究的有力工具,为进一步阐明苹果无性系变异机理奠定了基础。3、利用ARL5引物从元帅短枝芽变品种‘玫瑰红’中发现了一条特异片段,测定了其序列;并成功将IRAP标记转化为SCAR标记。建立的SCAR标记体系为:反应总体积为25μL,内含模板DNA50 ng,10×Buffer 2.5μL,Mg 3.0 mmo1,dNTPs 0.2 mmo1-L,引物各0.2μmo1-L,Taq DNA聚合酶1 U。本试验成功将IRAP标记转化为SCAR标记,为苹果的分子标记辅助育种工作奠定基础。4、反向PCR技术是对已知序列DNA的两侧未知序列进行扩增和研究的方法。本试验建立了IPCR酶切体系:50μL的体系中含有2μg基因组DNA、5 U限制性内切酶HindⅢ;酶切产物环化自连体系:50μL体系中约0.8μg单酶切基因组DNA、5μL10×T4连接缓冲液、5 U T4DNA连接酶,16℃连接过夜;IPCR反应体系:50μL体系中约40 ng环化自连接产物、5μL 10×LA PCR Buffer(Mg plus)、0.2 mmo1-L dNTPs、0.4μmo1-LIP1和IP2引物、2.5 U TaKaRa LA Taq聚合酶。IPCR扩增程序为:94℃4 min,94℃l min,60℃1.5 min,72℃4 min,循环35次;72℃10 min。利用建立的IPCR技术成功克隆了长度为1.5kb的特异片段旁侧序列。

关键词：苹果逆转录转座子 IRAP-PCR 指纹图谱 SCAR标记反向PCR

灵长类动物SAMHD1蛋白的细胞学功能保守性研究

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灵长类动物SAMHD1蛋白的细胞学功能保守性研究

作者：李爽吉林大学

学位级别：硕士

目的:探讨不同灵长类动物SAMHD1蛋白的抗病毒、抑制逆转录转座子LINE-1和减弱干扰素产生信号通路等作用,为灵长类动物SAMHD1蛋白的进一步研究提供依据。方法:构建稳定表达SAMHD1蛋白的U937细胞系,以空载体构建的细胞作为空白对照组,以... 详细信息

目的:探讨不同灵长类动物SAMHD1蛋白的抗病毒、抑制逆转录转座子LINE-1和减弱干扰素产生信号通路等作用,为灵长类动物SAMHD1蛋白的进一步研究提供依据。方法:构建稳定表达SAMHD1蛋白的U937细胞系,以空载体构建的细胞作为空白对照组,以稳定表达不同灵长类动物SAMHD1蛋白的U937细胞系为实验组。经佛波酯刺激分化成巨噬样细胞后,采用流式细胞术分析HIV-1-GFP病毒在不同实验组中的感染率。以单独转染SAMHD1表达质粒的HEK293T细胞为对照组,共同转染SAMHD1与HIV-2/SIV Vpx表达质粒的细胞为实验组,转染后48 h收获细胞,采用蛋白印迹实验检测SAMHD1蛋白水平,免疫荧光检测方法观察不同SAMHD1蛋白的细胞内定位。以单独转染LINE-1-GFP报告质粒的HEK293T细胞作为对照组,以共同转染LINE-1-GFP与SAMHD1表达质粒的细胞为实验组,采用流式细胞术检测GFP阳性细胞率。以单独转染IFN-luc报告质粒的HEK293T细胞为对照组,共同转染IFN-luc与SAMHD1表达质粒的细胞为实验组,采用化学发光仪检测HEK293T细胞中荧光素酶的表达水平。结果:抗病毒实验中,与对照组比较,灵长类动物SAMHD1稳定表达的实验组HIV-1细胞感染率明显降低(P逆转录转座子LINE-1以及拮抗天然免疫系统产生干扰素的作用。

关键词：灵长类动物 SAMHD1 逆转录病毒逆转录转座子 Vpx

核盘菌重寄生真菌盾壳霉T-DNA插入突变体ZS-1N23006的初步研究

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核盘菌重寄生真菌盾壳霉T-DNA插入突变体ZS-1N23006的初步研究

作者：汪红武华中农业大学

学位级别：硕士

盾壳霉(Coniothyrium minitans)是核盘菌(Sclerotinia sclerotirium)的重寄生菌,是一种重要的生防菌。本文以从盾壳霉ZS-1菌株T-DNA标记插入突变体库中筛选到的产孢缺陷型突变体ZS-1N23006菌株为材料进行了初步研究,其研究结果如下:突变... 详细信息

盾壳霉(Coniothyrium minitans)是核盘菌(Sclerotinia sclerotirium)的重寄生菌,是一种重要的生防菌。本文以从盾壳霉ZS-1菌株T-DNA标记插入突变体库中筛选到的产孢缺陷型突变体ZS-1N23006菌株为材料进行了初步研究,其研究结果如下:突变体ZS-1N23006的产生抗细菌物质的能力、抗真菌物质能力以及寄生菌核的能力和野生菌株ZS-1没有显著的差别,但是生长速度显著下降。在PDA培养基上,突变体ZS-1TN23006菌株几乎不产孢,而且对环境的pH≧7敏感,在pH大于7.0的基质中不能生长。在与野生菌株对峙培养时,接触部位可以恢复产孢,表明突ZS-1N23006缺乏一种与产孢相关的分泌性物质。Southern杂交证实T-DNA标记在突变体ZS-1N23006中为单位点插入;采用反向PCR技术对T-DNA标记插入位点的基因组DNA进行了克隆,获得了大小为1120bp的DNA片段,进一步从野生菌株ZS-1的基因组中获得3624bp的DNA片段,T-DNA插入部位在1660bp处,对克隆到的序列进行信息分析,发现在85bp到496bp之间有一个编码磷酸水解酶(Phos)基因的同源性序列,编码方向为3'-5'方向;在1416bp到1789bp,2944bp到3396bp之间编码逆转录酶基因(RT)的同源性序列,且在逆转录酶基因的同源性序列存在GDD的motif,逆转录酶编码方向为5'-3'方向,BLAST分析结果表明T-DNA标记插入可能破坏了磷酸水解酶基因的启动子部分,也可能破坏了一个含有逆转录酶结构域的假定蛋白基因的外显子部分,但RT-PCR结果表明在ZS-1或突变体Phos不表达;而RT基因在野生菌株ZS-1表达,在突变体中不表达。其中逆转录酶基因和逆转录转座子相关,目前在真菌中尚未见有关逆转录转座子的生物学功能的报道。本研究结果表明逆转录转座子可能与盾壳霉的分生孢子形成和对pH≧7不能生长相关,而Phos与突变体ZS-1N23006产孢缺陷和对pH≧7不能生长是否相关有待进一步研究。

关键词：盾壳霉分生孢子形成产孢缺陷 pH(?)7 逆转录酶逆转录转座子

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RNA m^(6)A修饰对基因转录的调控

生命的化学 2023年第4期43卷 486-493页

作者：朱光宇孙亚男哈尔滨医科大学附属第二医院耳鼻咽喉科哈尔滨150081

N^(6)-甲基腺嘌呤(N^(6)-methyladenosine,m^(6)A)是真核生物RNA中的一种最为普遍的表观遗传修饰,拥有大量的识别蛋白以及复杂的调控网络,能够发挥基因表达调控及细胞命运决定等功能。m^(6)A不仅在转录后水平调控基因表达,也广泛参与了... 详细信息

N^(6)-甲基腺嘌呤(N^(6)-methyladenosine,m^(6)A)是真核生物RNA中的一种最为普遍的表观遗传修饰,拥有大量的识别蛋白以及复杂的调控网络,能够发挥基因表达调控及细胞命运决定等功能。m^(6)A不仅在转录后水平调控基因表达,也广泛参与了基因转录水平的调控。m^(6)A可以通过影响RNA聚合酶启动子近端暂停、R-环形成等过程对转录起直接调控作用,也能够通过影响染色质的结构及活性间接调控转录。本文对m^(6)A及m^(6)A的共转录写入进行了简要介绍,重点讨论了m^(6)A对基因的转录水平调控以及相关的生物学功能。

关键词： N^(6)-甲基腺嘌呤染色质状态基因转录逆转录转座子

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陆地棉RVT＿3基因家族的全基因组分析

南通大学学报(自然科学版) 2024年

作者：谷海静孙康泰唐峻峰吴赟浩高昕陈俊宇李烨雄杨一轩汪保华南通大学生命科学学院江苏省南通中学

土壤盐碱化导致的盐胁迫限制植物的生长发育，对农业生产具有极大挑战，严重限制了农业生产力的发展。为实现由治理盐碱地适应作物，向选育耐盐碱植物适应盐碱地转变，需要发掘有效的作物耐盐基因。RVT＿3基因家族属于逆转录转座子家族... 详细信息

土壤盐碱化导致的盐胁迫限制植物的生长发育，对农业生产具有极大挑战，严重限制了农业生产力的发展。为实现由治理盐碱地适应作物，向选育耐盐碱植物适应盐碱地转变，需要发掘有效的作物耐盐基因。RVT＿3基因家族属于逆转录转座子家族，其结构域普遍存在于植物中。我们前期基于陆地棉盐胁迫转录组分析发现该家族系列基因与耐盐相关；在此基础上，本研究借助PFam数据库对此家族进行生物信息学分析，从陆地棉的全基因组中筛选得到了173个基因。本研究对这173个基因进行了系统发育、基因结构、染色体定位、基因复制等分析研究，同时对家族基因的顺式作用元件进行了鉴定分析。染色体定位分析表明，RVT＿3基因发生了许多片段复制事件，系统发育分析、基因结构分析以及保守基序分析说明处于同一家族的基因具有相似的基因结构和相似的保守基序，顺式作用元件分析表明，该基因家族可能参与各种生物和非生物胁迫响应。这些RVT＿3蛋白被分为3个不同的亚家族；在不同亚组中的不同基因有相似的基因结构证实了家族的分化方向；173个基因中有146个基因定位在陆地棉26条染色体上。此外，我们还通过RT-qPCR证实该基因家族确实响应陆地棉盐胁迫。这些结果为阐明RVT＿3基因家族的进化关系和功能特征提供了有价值的信息，也为进一步探究棉花耐盐响应机制，从而服务于棉花耐盐分子育种奠定了基础。

关键词： RVT_3 基因家族盐胁迫逆转录转座子

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遗传学

中国医学文摘(基础医学) 2004年第1期21卷 1-4页

关键词：遗传学 PCR 基因座核心序列外显子基因型频率 TPMT 中华医学遗传学杂志易感位点冠状病毒遗传学报逆转录转座子家系成员李锦基因多态性遗传多态性鼻咽癌患者

低温压力下LINE1在细胞中的作用机制研究

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低温压力下LINE1在细胞中的作用机制研究