小麦体细胞杂交渐渗引起的遗传变异及小麦发育相关基因TaHTD的功能研究

作     者：孔丽娜 

作者单位：山东大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘树伟

授予年度：2015年

学科分类：09[农学] 0901[农学-作物学] 

主      题：小麦 非对称体细胞杂交 逆转录转座子 基因表达变异 TaHTD 

摘      要：小麦是世界上重要的粮食作物之一,因此小麦育种改良对于粮食的增产是十分重要的。本实验室利用不对称体细胞杂交技术,已经获得了多种具有不同表型的小麦渐渗系后代。本实验对多种杂交渐渗系中部分同源基因的表达变异,DNA甲基化修饰的变异以及逆转录转座子的改变等情况进行了深入分析。利用SSCP技术比较分析了济南177和各渐渗系中部分基因的表达情况,发现在检测的80对引物中,有11对引物在渐渗系和亲本小麦中存在基因表达差异。通过MSAP分析所检测的210个亲本JN177特异CCGG位点中,与JN 177相比,在6个体细胞杂种渐渗系中出现高甲基化变异的位点所占比例为10.5%,而出现去甲基化变异的位点所占比例为13.1%;我们通过重亚硫酸盐测序技术对MSAP检测到的4个变异位点所在的DNA片段进行了胞嘧啶甲基化修饰状态的具体分析。REMAP/IRAP分析发现在被检测的219个位点中,与亲本济南177相比,6个体细胞杂种渐渗系中3.2%的逆转录转座子相关序列发生消减,同时有3.3%新条带的出现。利用MSTD技术比较分析了亲本济南177及各杂种渐渗系中Veju和BARE-1两种高拷贝逆转录转座子侧翼序列的DNA甲基化修饰状态,发现与亲本济南177相比,在杂种渐渗系中两种逆转录转座子的35%-40%侧翼序列上出现DNA甲基化变异。以上实验结果为进一步研究渐渗系的不同表型及性状与非对称杂交引起的遗传与表观遗传变异之间的关系奠定了理论基础。利用实验室已有的济南177和山融3号盐胁迫转录组数据,克隆了一个差异表达基因TaHTD,并对其进行了基因功能的初步研究。该基因编码区全长为678碱基,编码一个含225个氨基酸的锌指类转录因子。体外转录激活活性分析表明该基因编码的蛋白具有转录激活活性,亚细胞定位结果表明该蛋白在细胞核、细胞质中普遍存在。为了研究TaHTD基因在植物体内所发挥的功能,我们将其在拟南芥中进行了异源过量表达,发现转基因拟南芥植株的株高明显低于野生型且分枝数明显多于野生型,表明TaHTD基因可以显著影响转基因拟南芥的生长发育。通过qRT-PCR检测了转基因拟南芥与野生型拟南芥中与分枝相关Marker基因表达量情况,发现与野生型Col-0相比,过表达株系中与独脚金内酯相关的AtMAX3、AtMAX4、AtBESl均表达上调,而AtMAX1、AtBRC1、AtD27均表达下调。因此推测,TaHTD转基因拟南芥分枝数的明显增多可能是通过影响独脚金内酯信号通路来实现的。另外,通过NaCl、PEG胁迫条件下小麦中TaHTD基因的表达模式分析结果,可推测TaHTD可能参与到NaCl和PEG的非生物胁迫响应途径中。以上实验结果可以为小麦植株形态的定向改良提供理论基础,并且可以为了解逆境响应和株型发育之间的联系提供机会。