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Curcumin通过增强Rab7表达促进自噬体的轴突运输

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Curcumin通过增强Rab7表达促进自噬体的轴突运输

作者：康清梅重庆医科大学

学位级别：硕士

目的:阿尔茨海默病(AD)是一种起病隐匿的中枢神经系统退行性变性疾病。自噬作为一种真核细胞内重要的蛋白质降解途径,与AD的发生发展密切相关。自噬体大量堆积在轴突末端不能与溶酶体结合不仅影响了Aβ的代谢,更容易引起自噬应激导致神... 详细信息

目的:阿尔茨海默病(AD)是一种起病隐匿的中枢神经系统退行性变性疾病。自噬作为一种真核细胞内重要的蛋白质降解途径,与AD的发生发展密切相关。自噬体大量堆积在轴突末端不能与溶酶体结合不仅影响了Aβ的代谢,更容易引起自噬应激导致神经细胞死亡。Rab7是一种小GTP酶,在自噬体的成熟以及自噬体与溶酶体的融合中都发挥着重要作用。研究表明,curcumin(姜黄素)作为一种多酚类植物化合物,在AD中起神经保护作用,但其作用机制尚有待进一步研究。本研究拟通过体外研究的方法,首先验证curcumin减少Aβ的沉积以及对AD的神经保护作用;再观察curcumin对自噬及自噬流的影响;紧接着进一步研究其对自噬体轴突运输的作用;最后探讨其作用机制是否与Rab7的表达有关。本研究选择一个新的视角探讨curcumin对AD的作用机制,为AD的治疗提供新的靶点、新的思路。方法:首先将细胞分为4组:WT组(N2a/WT细胞)、Control组(N2a/APP695swe细胞)、Sham组(经5μM DMSO溶液处理24h的N2a/APP695swe细胞)、Curcumin组(经5μM curcumin溶液处理24h的N2a/APP695swe细胞)。流式细胞术用于检测各组细胞凋亡率和线粒体膜电位的变化。ELISA实验用于检测各组细胞上清液中Aβ的表达。通过透射电镜和激光共聚焦显微镜进一步观察各组细胞中自噬体及自噬溶酶体数量的变化,并运用Western Blot检测LC3II、SQSTM1、Beclin1、Atg7、Atg16L1、Dynein、KIF3B以及Rab7的表达。q RT-PCR用于检测Rab7在分子水平的表达。然后进一步在N2a/APP695swe细胞中转染pc DNA3.1、pc DNA3.1-Rab7、NC-si RNA、Rab7-si RNA后,将细胞分为5组:Control组、pc DNA3.1组、pc DNA3.1-Rab7组、NC-si RNA组、Rab7-si RNA组,再次用流式细胞术检测各组中细胞凋亡率和线粒体膜电位的变化,ELISA检测各组中Aβ的表达,透射电镜和激光共聚焦显微镜观察各组细胞中自噬体及自噬溶酶体数量的变化,Western Blot检测LC3II、SQSTM1、Dynein、KIF3B蛋白的表达情况。结果:与Control组相比,经curcumin处理细胞24h后,细胞凋亡率明显降低(P=0.000),线粒体膜电位升高(P=0.000),细胞上清液中Aβ的含量减少(P=0.000);透射电镜和激光共聚焦显微镜均显示自噬体增加,且自噬溶酶体数量也增加;Western Blot检测发现LC3II、Beclin1、Atg7、Atg16L1、Dynein以及Rab7的表达均增多(P=0.000;P=0.000;P=0.000;P=0.003;P=0.000;P=0.000),而SQSTM1和KIF3B的表达降低(P=0.000;P=0.000);q RT-PCR结果显示Rab7在m RNA水平表达也有所增加(P=0.000)。在N2a/APP695swe细胞中转染Rab7过表达载体后,与Control组相比,细胞凋亡率降低(P=0.000),线粒体膜电位增加(P=0.000),细胞上清液中Aβ的含量减少(P=0.000);透射电镜和激光共聚焦显微镜结果显示自噬体和自噬溶酶体数量也增加;Western Blot结果表明虽然LC3II的表达无明显差异(P=0.865),但SQSTM1表达明显减少(P=0.000),Dynein和KIF3B的表达有所增加(P=0.000;P=0.000)。在N2a/APP695swe细胞中转染Rab7干扰RNA后,其结果与转染Rab7过表达载体相反。结论:Curcumin可以降低N2a/APP695swe细胞凋亡率、升高线粒体膜电位、减少Aβ的产生、并增强自噬体的轴突运输从而促进自噬及自噬流,其机制可能与调节Rab7的表达有关。

关键词：阿尔茨海默病 curcumin 自噬轴突运输 Rab7

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逆向轴突运输障碍与肌萎缩侧索硬化

临床神经病学杂志 2015年第2期28卷 150-152页

作者：解渊储佺兵马鞍山市十七冶医院神经内科 243000

肌萎缩侧索硬化（ ALS ）是运动神经元变性疾病，特异性损害运动神经细胞。典型临床表现包括肌肉无力、强直以及萎缩，自然病程约2～5年。大部分患者为散发病例，10％的患者属于家族遗传性。迄今为止还没有治疗肌萎缩侧索硬化的有效方法... 详细信息

肌萎缩侧索硬化（ ALS ）是运动神经元变性疾病，特异性损害运动神经细胞。典型临床表现包括肌肉无力、强直以及萎缩，自然病程约2～5年。大部分患者为散发病例，10％的患者属于家族遗传性。迄今为止还没有治疗肌萎缩侧索硬化的有效方法。 ALS具体发病机制尚不明确。神经营养因子等经逆向轴突运输由神经末梢输送到神经元胞体，维持神经细胞的存活及功能。在ALS患者及动物模型中都发现了逆向轴突运输障碍。其在ALS发生、发展中具有重要作用，并有望成为治疗ALS的新途径。本文就逆向轴突运输障碍导致ALS的可能机制作一综述。

关键词：肌萎缩侧索硬化轴突运输逆向运动神经元变性疾病运动神经细胞神经营养因子 ALS 特异性损害

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突触可塑性和轴突运输在痛觉过敏中的作用

川北医学院学报 2018年第5期33卷 662-666页

作者：杨菁张从利西电集团医院麻醉科陕西西安710077

目的:从突触可塑性和轴突运输探究坐骨神经损伤大鼠模型痛觉过敏的机制。方法:采用坐骨神经慢性压迫性损伤(chronic compression injury,CCI)诱导大鼠外周神经性疼痛,检测CCI后大鼠机械性痛觉过敏、冷触诱发痛以及热痛觉过敏的指标。实... 详细信息

目的:从突触可塑性和轴突运输探究坐骨神经损伤大鼠模型痛觉过敏的机制。方法:采用坐骨神经慢性压迫性损伤(chronic compression injury,CCI)诱导大鼠外周神经性疼痛,检测CCI后大鼠机械性痛觉过敏、冷触诱发痛以及热痛觉过敏的指标。实时定量PCR检测CCI后14 d及21 d的大鼠同侧L4-6背根神经节中GAP-43、NCAM、PSD-95、Syp、kinesin和dynein的表达。结果:CCI术后14 d大鼠的机械性痛觉过敏、冷触诱发痛以及热痛觉过敏指标均降低(P均轴突运输启动。

关键词：痛觉过敏突触可塑性轴突运输实时定量PCR 坐骨神经损伤

锌离子在交感干的轴突运输以及锌缺乏对交感干结构影响的研究

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锌离子在交感干的轴突运输以及锌缺乏对交感干结构影响的研究

作者：王玥中国医科大学

学位级别：硕士

前言锌是人体内重要的微量元素之一,是正常生长发育、基因表达、蛋白质代谢、免疫功能等过程中所必需的元素。近年来,人们对锌与神经系统生长发育以及功能调节之间的关系进行了广泛的研究,发现锌缺乏可以引起神经系统多种疾病的发... 详细信息

前言锌是人体内重要的微量元素之一,是正常生长发育、基因表达、蛋白质代谢、免疫功能等过程中所必需的元素。近年来,人们对锌与神经系统生长发育以及功能调节之间的关系进行了广泛的研究,发现锌缺乏可以引起神经系统多种疾病的发生。在中枢神经系统中,大部分锌离子与蛋白质结合并维持蛋白质分子的三级结构,小部分的锌离子以游离方式存在于含锌神经元（zinc-enriched neuron,ZEN）轴突终末的突触小泡中。在突触活动中锌离子与谷氨酸、γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid,GABA）等神经递质共同释放到突触间隙,参与学习和记忆的形成、神经系统发育以及运动和感觉功能的调节。锌离子也存在于周围神经系统中,有文献报道几乎所有的颈上神经节（superior cervical ganglia,SCG）神经元中均有锌离子分布,电镜观察游离锌离子主要聚集在颈上神经节交感节后神经元核周的高尔基复合体和囊泡内,锌离子可能参与了神经元内某些含锌蛋白质的合成与组装,并维持某些蛋白质的三级结构。在脊神经节以及坐骨神经中锌离子也有广泛分布。然而,锌离子在周围神经系统神经元内的聚集转运机制以及功能尚不清楚。本研究对锌离子在交感干内的轴突运输以及锌缺乏对交感干神经纤维结构的影响进行了详细的研究。材料与方法 1、Wistar大鼠,体重约150g,雌雄不限,随机分成3组。（1）第一组进行单侧交感干钳夹手术,对侧未做手术作为对照,分别使其术后存活2、4、6小时,在此期间注射硒化钠,然后灌流取材,采用金属自显影（AMG）的方法观察锌离子在交感干中的轴突运输情况。（2）第二组采用与上述同样的手术方法,灌流取材后应用AMG电镜的方法观察锌离子在交感干中的分布情况。（3）第三组大鼠钳夹单侧交感干,在靠近钳夹点的上方注射硒化钠,同样另一侧未钳夹作为对照,24h后灌流取下两侧颈上神经节进行AMG染色,观察交感干中锌离子的逆行运输。 2、生后3周的CD-1小鼠随机分为正常组和缺锌组（ZnD）组,分别给予正常饲料和缺锌饲料喂养,5周后灌流取交感干,应用常规电镜技术观察交感干的结构改变,并在光镜下比较有髓神经纤维和无髓神经纤维的数量变化,应用t检验比较两组数据之间的差异。实验结果 1、交感干钳夹后,AMG实验结果中可以看到在两个钳夹点的远端和近端有AMG阳性颗粒的蓄积,此颗粒主要位于靠近钳夹点处,但是在两个钳夹点之间没有阳性颗粒的存在,并且AMG阳性颗粒随着手术后大鼠存活时间的延长而增多。 2、AMG电镜结果显示在无髓神经纤维中有锌离子的AMG阳性反应产物。 3、在交感干逆行运输的AMG实验结果中,光镜下观察颈上神经节中仅有约5%的神经元有锌离子阳性反应产物,弥散分布于神经元的胞质内,细胞核周围染色较深,细胞核未见阳性反应,一些神经元突起内可见点线状的AMG阳性颗粒。 4、锌缺乏后导致小鼠交感干超微结构的改变,表现为髓鞘变性、排列不规则、界限不清楚,神经纤维束膜萎陷,神经轴突的横截面积减小,形态异常的神经纤维数量增多。光镜下观察,缺锌小鼠交感干有髓神经纤维的数量减少,无髓神经纤维增多。讨论有文献报道,坐骨神经钳夹后通过AMG染色方法观察到AMG阳性反应颗粒存在于钳夹点两端,说明坐骨神经钳夹点的远侧端和近侧端有锌离子的蓄积,提示在坐骨神经中存在锌离子的轴突运输,电镜下观察缺锌情况下的坐骨神经超微结构,发现有髓神经纤维的数量和表面积与正常饲养的动物相比都有所减少,髓鞘破坏变得不规则,并且发生变性,这些都证明锌可能对周围神经的相关功能具有一定的作用,因而我们推测交感干中也有锌离子的运输,并且对其结构的保持及功能的发挥起到关键性作用。应用AMG和AMG电镜技术,本实验证实了游离锌离子在交感干的轴突内进行轴突运输。研究发现,钳夹手术后,注射硒化钠,在钳夹点的两侧端均有不同程度的锌离子蓄积,并且有随着手术后存活时间的延长锌离子蓄积增多的现象,提示大多数或全部交感节后含锌神经元胞体内的锌离子可能通过顺行运输到达轴突终末并参与某些生理功能的调节,而且也有锌离子由轴突终末向胞体逆行运输。应用AMG技术检测交感干注射硒酸钠24h后,锌离子在颈上神经节中含锌神经元的表达,光镜下结果显示,颈上神经节中约有5%神经元有AMG阳性反应产物,此结果进一步证实了锌离子在交感干中进行逆行的轴突运输。结论 1、交感干存在着锌离子的顺行和逆行运输,在手术后的大鼠交感干的染色切片中可以看到均匀的AMG阳性反应。 2、缺锌后交感干结构和数量的变化说明锌离子可能对周围神经纤维结构的保持及功能的发挥起到重要的作用。

关键词：锌离子交感干颈上神经节轴突运输中枢神经系统周围神经系统金属自显影

生物素葡聚糖胺观测周围神经局部轴突运输的实验研究

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中华实验外科杂志 2006年第2期23卷 160-163页

作者：王东生孙洪辉王心蕊路来金吉林大学第一医院手足外科长春现在130021 吉林大学第二医院骨科吉林大学医学部病理教研室

目的研究神经示踪剂生物素葡聚糖胺（BDA）用于直观观察周围神经局部轴突运输的可行性。方法（1）显露双侧兔坐骨神经，于实验侧及对照侧坐骨神经干注射不同浓度、不同剂量BDA，对照侧注射生理盐水，术后6、12、24、48h取样。于光镜... 详细信息

目的研究神经示踪剂生物素葡聚糖胺（BDA）用于直观观察周围神经局部轴突运输的可行性。方法（1）显露双侧兔坐骨神经，于实验侧及对照侧坐骨神经干注射不同浓度、不同剂量BDA，对照侧注射生理盐水，术后6、12、24、48h取样。于光镜及共聚焦显微镜下观察样本。（2）将兔左侧坐骨神经横断损伤并缝合，分别于术后1～6周于损伤近侧神经干注射10％BDA，12h后取标本观察。结果 10％BDA可清晰地在周围神经轴突内显像，操作简单，结果易于观察。同时，坐骨神经断伤术后3周时有明确的轴浆运输的恢复。结论 BDA神经干局部注射后能较清楚而直观地显示局部轴突运输的情况。

关键词：坐骨神经轴突运输神经示踪剂

HAP1促进神经细丝和致密核心大囊泡的轴突运输

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HAP1促进神经细丝和致密核心大囊泡的轴突运输

中国神经科学学会第四次会员代表大会暨第八届全国学术会议

作者：沈建英徐子辉贺军李和华中科技大学同济医学院解剖学系组织学与胚胎学室

亨廷顿蛋白相关蛋白1（huntingtin-associated protein 1,HAP1）参与细胞内的物质运输,但具体作用及机制不明确。在本实验中,通过荧光漂白恢复实验观察到,在N2a细胞中,HAP1促进神经细丝（neurofilamensNFs）的轴突运输;在PC12细胞中,HAP... 详细信息

亨廷顿蛋白相关蛋白1（huntingtin-associated protein 1,HAP1）参与细胞内的物质运输,但具体作用及机制不明确。在本实验中,通过荧光漂白恢复实验观察到,在N2a细胞中,HAP1促进神经细丝（neurofilamensNFs）的轴突运输;在PC12细胞中,HAP1促进致密核心大囊泡（large dense cored vesicles LDCVs）的轴突运输,但对类突触小囊泡（Synaptic vesicle-like microvesicle SLMVs）的轴突运输没有作用。免疫共沉淀研究发现,HAP1与糖原合成酶3β（Glycogen synthase 3 betaGSK-3β）具有相互作用。HAP1过表达时N2a和PC12细胞中丝氨9/21位点磷酸化的GSK-3β（p-GSK-3β,即失活的GSK-3β）显著增加,磷酸化的神经细丝重链（p-NFH）显著减少,而在沉默HAP1后则相反。GSK-3β是一种广泛表达的丝氨酸/苏氨酸蛋白酶,能磷酸化驱动蛋白轻链（kinesinlightchains KLCs）并抑制驱动蛋白介导的轴突运输。驱动蛋白是一种重要的动力蛋白,介导神经元内沿微管进行的顺向轴突运输。驱动蛋白磷酸化时,其与被运输物质间的结合力减弱,被运输物质易与驱动蛋白分离,导致顺向快速运输受阻。我们的研究结果显示HAP1可能通过抑制GSK-3β的活性,减少KLCs的磷酸化,增强驱动蛋白与NFs和LDCVs间的结合力,从而促进其在神经元轴突中的运输。

关键词：亨廷顿蛋白相关蛋白1 神经细丝致密核心大囊泡轴突运输糖原合成酶3β 磷酸化

来源： cnki会议评论

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游离锌离子轴突运输的实验研究

中国组织化学与细胞化学杂志 2003年第2期12卷 131-133页

作者：王占友何峥刘琰沙儒石玉秀中国医科大学组织胚胎学教研室沈阳110001 中国医科大学第一临床学院沈阳110001

目的　研究大鼠坐骨神经结扎后游离锌离子在轴突内的定位分布 ,探讨锌离子在含锌神经元内的轴突运输。方法　应用轴流阻滞 /神经结扎术结合光、电镜锌金属自显影技术 ,检测含锌神经元轴突内的游离锌离子。结果　锌阳性反应产物主要分布... 详细信息

目的　研究大鼠坐骨神经结扎后游离锌离子在轴突内的定位分布 ,探讨锌离子在含锌神经元内的轴突运输。方法　应用轴流阻滞 /神经结扎术结合光、电镜锌金属自显影技术 ,检测含锌神经元轴突内的游离锌离子。结果　锌阳性反应产物主要分布在靠近结扎点的坐骨神经近端和远端轴突内 ,并且随着结扎时间的延长锌离子在轴突近端和远端的积累逐渐增加。此外 ,电镜结果表明锌离子主要定位于无髓神经纤维以及薄髓鞘的有髓神经纤维轴突内。结论　游离锌离子在含锌神经元轴突内进行双向轴突运输 ,即顺行运输和逆行运输。

关键词：坐骨神经轴突运输大鼠锌

骨架蛋白异常磷酸化对神经细丝轴突运输的影响及其机制研究

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骨架蛋白异常磷酸化对神经细丝轴突运输的影响及其机制研究

湖北省暨武汉生物化学与分子生物学学会第八届会员代表大会...

作者：陈娟冯友梅王建枝华中科技大学同济医学院生物化学与分子生物学系

神经元轴突呈现萎缩,胞浆蛋白异常聚积及其运输机能的进行性丧失是发生神经退行性疾病(neurodegenerative disease)的主要病理特征。而神经元的结构和功能的维持均有赖于神经元内正常的快、慢轴突运输的功能而实现。因此,深入研究神经... 详细信息

神经元轴突呈现萎缩,胞浆蛋白异常聚积及其运输机能的进行性丧失是发生神经退行性疾病(neurodegenerative disease)的主要病理特征。而神经元的结构和功能的维持均有赖于神经元内正常的快、慢轴突运输的功能而实现。因此,深入研究神经元内物质运输异常的分子机制具有重要意义。阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是最常见的一种神经退行性疾病。AD两大病理特征是老年斑(senile plaque,SP)和神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFTs),而NFTs的主要组分是异常过度磷酸化的细胞骨架蛋白(如tau蛋白),后者聚积在退化的神经元胞体并与AD患者的临床痴呆程度呈正相关,这一现象强烈提示骨架蛋白异常磷酸化与神经元退化之间存在内在联系。因此,探讨骨架蛋白异常磷酸化与神经元退化之间的联系是有关研究领域的热点课题。本研究从细胞和分子水平,对神经元骨架蛋白异常磷酸化及其可能的机制;以及神经元骨架蛋白异常磷酸化与神经元轴突运输之间的关系进行了较为系统的探讨,获得了一些创新性的研究结果,简述如下:

关键词：阿尔茨海默病神经细丝 tau蛋白磷酸化轴突运输细胞周期依赖性蛋白激酶-5 糖原合酶激酶-3 全内反射荧光显微镜绿色荧光蛋白

来源： cnki会议评论

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神经轴突中信号转导内体运输的研究方法

中国药理学通报 2015年第3期31卷 308-311页

作者：邹丽芳黄安梁尚栋南昌大学基础医学院生理教研室江西南昌330006 江西财经大学职业技术学院江西南昌330013

神经元之间的信息交流及其生长发育与轴突运输密切相关。轴突运输中信号分子通过激活相关受体形成配体-受体复合物,在细胞内吞作用下进入内体,形成神经元轴突中的胞内吞细胞器。胞内吞细胞器从轴突运输至胞体,这种细胞器称为信号转导内... 详细信息

神经元之间的信息交流及其生长发育与轴突运输密切相关。轴突运输中信号分子通过激活相关受体形成配体-受体复合物,在细胞内吞作用下进入内体,形成神经元轴突中的胞内吞细胞器。胞内吞细胞器从轴突运输至胞体,这种细胞器称为信号转导内体。内体运输受损影响神经元的生存,了解轴突及内体运输这一过程的研究方法将有助于寻找相关疾病的病因和防治方法。该文就神经元轴突及内体运输的研究方法进行综述。

关键词：轴突运输信号内体神经元神经营养因子配体-受体复合物研究方法