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双歧杆菌和乳酸菌β-半乳糖苷酶转糖基作用的研究进展

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食品科学 2019年第7期40卷 335-341页

作者：姜陈波杭锋乳业生物技术国家重点实验室上海乳业生物工程技术研究中心光明乳业股份有限公司乳业研究院上海200436

双歧杆菌和乳酸菌作为一般认为安全的微生物,是β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,β-gal)的较好来源。部分双歧杆菌和乳酸菌菌株能够产生具有转糖基活力的β-gal,以乳糖为底物可合成具有益生作用的低聚半乳糖(galactooligosaccharides,GO... 详细信息

双歧杆菌和乳酸菌作为一般认为安全的微生物,是β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,β-gal)的较好来源。部分双歧杆菌和乳酸菌菌株能够产生具有转糖基活力的β-gal,以乳糖为底物可合成具有益生作用的低聚半乳糖(galactooligosaccharides,GOS),而GOS产物的产量和组成受到β-gal的来源以及反应条件的影响。因此,本文总结了能够产生具有转糖基活力的β-gal的双歧杆菌和乳酸菌菌株,比较了两类来源的β-gal的酶学性质,并重点阐述了这两类β-gal在GOS合成中的应用。

关键词： β-半乳糖苷酶乳酸菌双歧杆菌转糖基作用低聚半乳糖

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阿卡维基转移酶的异源表达及转糖基作用

食品科学 2024年

作者：薛正莲王雨晴李闯李丹丹朱司宝李翔飞安徽工程大学生物与食品工程学院

为深入研究阿卡波糖合成途径中关键酶——阿卡维基转移酶的结构性质和催化功能，从犹他游动放线菌Actinoplanes sp. SE50基因组中扩增其编码基因acb D，并实现在E. coli中的异源表达。生物信息学分析表明acb D表达产物ATase的保守结构... 详细信息

为深入研究阿卡波糖合成途径中关键酶——阿卡维基转移酶的结构性质和催化功能，从犹他游动放线菌Actinoplanes sp. SE50基因组中扩增其编码基因acb D，并实现在E. coli中的异源表达。生物信息学分析表明acb D表达产物ATase的保守结构域与α-淀粉酶Glycoside hydrolases 13超家族的环糊精糖基转移酶高度相似，且存在信号肽和跨膜区。SDS-PAGE检测结果显示，在去除信号肽的编码序列后，acb D的可溶性表达水平提高了23.4倍。重组ATase的最适催化温度和pH分别为30 ℃和7.0。底物谱分析表明，重组ATase催化D-水杨苷的活力最高，为82.85 U/mL。其次是L-山梨糖的63.75 U/mL，也是首次发现L-山梨糖可作为ATase的优良糖基供体。以上结果为进一步明确ATase的催化机制奠定了基础。

关键词：阿卡维基转移酶阿卡波糖异源表达转糖基作用酶学性质

β葡萄糖苷酶的转糖基作用主产物及其对纤维素酶合成的？…

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中山大学学报（自然科学版） 1999年第2期38卷 70-74页

作者：艾云灿高培基中山大学生命科学学院

以纤维二糖特异诱导培养里氏木霉和黑曲霉菌丝，制备含有细胞外，细胞内和细胞质膜结合态β－葡萄苷酶的无细胞抽提物，采用色谱持谱联用分析，比较研究他们对纤维二糖的转糖基作用，结果表明两菌株中都只有细菌质膜结合态β－葡萄糖苷... 详细信息

以纤维二糖特异诱导培养里氏木霉和黑曲霉菌丝，制备含有细胞外，细胞内和细胞质膜结合态β－葡萄苷酶的无细胞抽提物，采用色谱持谱联用分析，比较研究他们对纤维二糖的转糖基作用，结果表明两菌株中都只有细菌质膜结合态β－葡萄糖苷酶表现出显著的转糖基活性，

关键词： β-葡萄糖苷酶转糖基作用纤维素酶合成

Exo-α-唾液酸苷酶：基因挖掘、转糖基作用及分子改造

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Exo-α-唾液酸苷酶：基因挖掘、转糖基作用及分子改造

作者：郭龙成山东大学

学位级别：硕士

人乳寡糖（Human milk oligosaccharides,HMOs）在人乳中大量存在,具有重要的生理功能,能促进婴幼儿肠道有益菌尤其是双歧杆菌的增殖,并作为抗微生物黏附药物降低微生物感染,还能调节免疫反应等。唾液酸寡糖是人乳寡糖的重要组分,大量... 详细信息

人乳寡糖（Human milk oligosaccharides,HMOs）在人乳中大量存在,具有重要的生理功能,能促进婴幼儿肠道有益菌尤其是双歧杆菌的增殖,并作为抗微生物黏附药物降低微生物感染,还能调节免疫反应等。唾液酸寡糖是人乳寡糖的重要组分,大量存在于初乳中（1-3.3g/L）,其中以6’唾液酸乳糖含量最多（0.25-1.3 g/L）。该类寡糖对新生儿的益生功能显著,包括抗病原体感染、促进肠道成熟、促进免疫功能及大脑和认知发育等。尽管HMOs在人乳中大量存在,但在牛奶中含量较少。近年来,一些功能性寡糖如低聚半乳糖和低聚果糖已被作为益生元成功添加到婴幼儿配方奶粉中,但由于唾液酸独特的结构和负电性,其生理功能不能完全被其他寡糖替代,因而人工合成天然的唾液酸寡糖备受关注。目前获得唾液酸寡糖的方法主要有化学法和酶法。化学法涉及复杂的保护和去保护步骤,并且唾液酸是一个九碳酸性糖,比一般的六碳糖更加难以修饰。酶法能催化糖链一步合成,步骤简单。其中,唾液酸糖基转移酶需要十分昂贵的糖基供体（CMP-Neu5Ac）且底物选择性严格;而exo-α-唾液酸苷酶（exo-α-sialidase,EC.3.***.1.18）的底物价格大大低于糖基转移酶,且来源广,底物选择性宽泛,在规模化合成方面有一定潜力。但目前报道的α-唾液酸苷酶主要合成α2-3唾液酸寡糖,虽然有几种细菌来源的唾液酸苷酶能够合成α2-6唾液酸寡糖,但这些酶区域选择性不严格,通常会合成α2-3唾液酸寡糖同分异构体,产物难以分离,并且产物转化率低于10%,而且反应使用的商品化的糖基供体如对硝基苯唾液酸或唾液酸二糖价格仍然偏高,在一定程度上限制了该类酶的规模化应用。本论文中我们通过 CAZY 数据库（http://***/***）分析发现肠道菌中的双歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）、脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis）和产气芽孢梭菌（Clostridium perfringens）的基因组中存在多个预测的exo-α-唾液酸苷酶基因,可能与肠道人乳寡糖和黏膜多糖降解相关。本文中,我们运用基因挖掘技术,筛选了 7个来自肠道菌的exo-α-唾液酸苷酶,包括3个来自脆弱拟杆菌（***）NCTC9343、3个来自产气芽孢梭菌（***）ATCC13124和1个已知的来自双岐双岐杆菌（***）JCM1254。对这7个不同exo-α-唾液酸苷酶进行了表达纯化、水解底物特异性实验,显示出该类酶具有广泛的底物特异性,能够水解α2-3、α2-6和α2-8各种不同键型唾液酸底物。我们以多聚唾液酸稀酸水解制备寡聚唾液酸供体,相对其它唾液酸供体具有价格更便宜、获取更方便等优点。转糖基筛选得到了一个来自脆弱拟杆菌（***）NCTC9343的唾液酸苷酶,将其命名为BfN3,该酶具有高转糖基活性,显示出能高效合成唾液酸化人乳寡糖。酶学性质研究发现,BfN3为非离子依赖的酸性中温糖苷水解酶;BfN3单体分子量为57.9kDa,活性态分子量为113.6kDa,该酶天然状态下为二聚体;BfN3对人工底物4-甲基伞形酮唾液酸、天然底物唾液酸二糖的Km和Kcat分别为0.06 mM、283.18s—1和0.75 mM、329.64s-1。该酶能够以唾液酸二糖或寡聚唾液酸为供体,以乳糖为受体,高效发生转糖基反应形成α2-6键型,不形成其他异构体。我们详细地研究了各种反应条件,包括底物浓度（供体和受体）、pH、温度和反应时间对BfN3转糖基反应的影响,发现在以40 mM唾液酸二糖或40 mg/ml寡聚唾液酸为供体、1 M乳糖和pH 6.5的反应条件下,于50℃反应10分钟,BfN43能够特异性催化形成6’唾液酸乳糖,最大转化率超过20%。对BfN3的受体选择性进行了研究,发现该酶受体范围宽泛,能以乳糖、蜜二糖、半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、葡萄糖多种糖受体为底物。该酶提供了一种有效的替代当前合成唾液酸寡糖的方法,显示出其巨大的理论及工业应用价值。唾液酸苷酶遵循糖苷酶反应的一般机制,反应产物可以作为底物被酶重新水解,即使优化反应条件也只能在一定范围内提高产物产量,因而我们对BfN3进行分子改造研究,以期获得高效率突变酶。首先采用了宏引物易错PCR技术对bfn3基因进行随机突变,以甲醇和乳糖为转糖基受体进行筛选,共累计筛选2457个突变酶,发现突变酶T1231效果最好,相对野生型BfN3转糖基能力（乳糖受体）提升41.5%。同时根据能高效合成α2-3唾液酸寡糖的唾液酸苷酶即克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）TcTS和布氏锥虫（Trypanosoma brucei）T

关键词： Exo-α-唾液酸苷酶脆弱拟杆菌NCTC9343 转糖基作用 6’唾液酸乳糖分子改造

N(2)-乙酰基-7-[(2-乙酰氧乙氧基)甲基]鸟嘌呤的转糖基作用

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精细化工中间体 2001年第4期31卷 13-14页

作者：罗晓燕武汉化工学院制药系湖北武汉430073

研究了N(2 ) 乙酰基 7 [(2 乙酰氧乙氧基 )甲基 ]鸟嘌呤通过转糖基作用生成其9位异构体N(2 ) 乙酰基 9 [(2 乙酰氧乙氧基 )甲基 ]鸟嘌呤的条件 ,转化率为 5 5 %。

关键词： N(2)-乙酰基-7-[(2-乙酰氧乙氧基)甲基]鸟嘌呤转糖基作用药物异物体阿昔洛韦

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唾液酸苷酶的催化机理及水解与合成寡糖进展

生物化学与生物物理进展 2019年第2期46卷 181-192页

作者：郭龙成马忠轩卢丽丽肖敏山东大学国家糖工程技术研究中心微生物技术国家重点实验室山东省糖化学生物学省级重点实验室青岛266237 华中科技大学同济医学院药学院武汉430074

唾液酸苷酶(EC.3.***.1.18)是一类重要的糖苷水解酶,在动物和微生物中广泛存在.该类酶催化寡糖或糖缀合物上非还原末端唾液酸水解,具有重要的生物学功能,如参与溶酶体降解代谢物、癌症发生、微生物致病等多种生理和病理过程.除了水解活性... 详细信息

唾液酸苷酶(EC.3.***.1.18)是一类重要的糖苷水解酶,在动物和微生物中广泛存在.该类酶催化寡糖或糖缀合物上非还原末端唾液酸水解,具有重要的生物学功能,如参与溶酶体降解代谢物、癌症发生、微生物致病等多种生理和病理过程.除了水解活性外,有的唾液酸苷酶还具有转糖基活性,能够以唾液酸单糖或糖苷为糖基供体,催化唾液酸转移到受体分子上,一步合成寡糖和糖苷化合物.这种合成活性对于唾液酸相关糖链的大量获得具有重要意义,有利于推动该类寡糖的基础研究及其在食品和医药中的应用.本文综述了唾液酸苷酶的结构和催化机理、生理功能、转糖基作用及其在寡糖合成中的应用.

关键词：唾液酸唾液酸苷酶结构及催化机理转糖基作用分子改造

转糖基β-半乳糖苷酶产生菌筛选和鉴定及酶催化生成低聚半乳糖

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山东大学学报（理学版） 2006年第1期41卷 133-139页

作者：王红妹肖敏李正义李玉梅钱新民山东大学微生物技术国家重点实验室

通过水解活性和转糖基活性筛选,从实验室97株保存菌种中获得1株具有转糖基活性的β-半乳糖苷酶产生菌,克隆并序列分析了该菌株16S rDNA基因片断,GenBank收录号为DQ267829.综合其形态学特征、生理生化特征及16S rDNA序列同源性分析结果,... 详细信息

通过水解活性和转糖基活性筛选,从实验室97株保存菌种中获得1株具有转糖基活性的β-半乳糖苷酶产生菌,克隆并序列分析了该菌株16S rDNA基因片断,GenBank收录号为DQ267829.综合其形态学特征、生理生化特征及16S rDNA序列同源性分析结果,将其鉴定为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)2-37-4-1.确定了该菌株β-半乳糖苷酶产酶培养基的碳源为乳糖1%,氮源为蛋白胨0.5%和酵母膏0.5%,培养条件为37℃摇床培养18 h;碳源实验证明,该菌株β-半乳糖苷酶产生为乳糖诱导型.利用薄层层析技术研究了pH值、乳糖底物浓度、反应温度和反应时间对该菌株β-半乳糖苷酶以乳糖为底物转糖基合成低聚半乳糖的影响,确定最适反应条件为pH7.5、50 mmol/L(磷酸缓冲液)配制的40%乳糖溶液,55℃反应24 h.转糖基反应产物高压液相色谱分析其组成为低聚半乳糖25.68%,双糖(包括乳糖和转移二糖)33.02%,葡萄糖26.37%和半乳糖14.92%.

关键词：巨大芽孢杆菌 16S rDNA β-半乳糖苷酶转糖基作用低聚半乳糖

布氏锥虫来源内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶的异源表达和活性鉴定

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食品与发酵工业 2018年第8期44卷 8-13页

作者：崔娟喜多岛敏彦王宁中西秀树高晓冬江南大学生物工程学院江苏无锡214122

内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷内切酶(Endo-β-N-acetylglucosaminidase,ENGase)是一类可以水解N-糖链中核心壳二糖之间β-1,4-糖苷键的糖苷内切酶,其中糖苷水解酶85家族(glycoside hydrolasefamilies 85,GH85)的ENGase除了水解活性之外还具有转糖基活性,能够以切除后再将均一的寡糖链转移到N-糖蛋白的β-N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine,GlcNAc)上的方式,改造医药糖蛋白的N-糖基化修饰。通过数据库检索,在布氏锥虫(Trypanosoma brucei)的基因组中找到了GH85家族ENGase的同源序列,并命名为Endo-Tb基因,对其克隆后在带有Nus融合蛋白的原核(***)表达载体上成功表达并纯化。检测到融合蛋白Nus-Endo Tb能够水解高甘露糖型和双天线的复合型糖链,但不能作用于三天线的复合型糖链。同时Nus-Endo Tb可以水解核糖核酸酶B和人类转铁蛋白上的N糖链。当用唾液酸糖肽(SGP)作为糖基供体,MU-GlcNAc作为糖基受体时,通过荧光基质底物四甲基伞形酮(MU)检测到Nus-Endo Tb具有转糖基活性。

关键词：内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷内切酶转糖基作用布氏锥虫 Nus-Endo Tb

β-N-乙酰氨基己糖苷酶及其合成寡糖的研究进展

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微生物学报 2017年第8期57卷 1189-1205页

作者：陈晓迪王凤山肖敏山东大学微生物技术国家重点实验室山东济南250100 国家糖工程技术研究中心山东省糖化学生物学省级重点实验室山东济南250100 山东大学药学院山东济南250100

β-N-乙酰氨基己糖苷酶(EC.3.***.1.52)是一类重要的糖苷水解酶,在自然界中催化简单的β-N-乙酰氨基己糖苷或复杂的寡糖链、多糖链中末端N-乙酰己糖苷键的水解,在微生物、植物和动物中广泛分布,具有重要的生物学功能。某些种类的β-N-乙... 详细信息

β-N-乙酰氨基己糖苷酶(EC.3.***.1.52)是一类重要的糖苷水解酶,在自然界中催化简单的β-N-乙酰氨基己糖苷或复杂的寡糖链、多糖链中末端N-乙酰己糖苷键的水解,在微生物、植物和动物中广泛分布,具有重要的生物学功能。某些种类的β-N-乙酰氨基己糖苷酶在一定的人为条件下水解β-N-乙酰氨基己糖苷键的同时还具有转糖基作用,能将β-N-乙酰氨基己糖基转移到不同的羟基化合物上,合成β-N-乙酰氨基己糖苷化合物,在糖链合成上具有应用的潜力。本文综述了β-N-乙酰氨基己糖苷酶的结构和催化机制、酶的生物学功能以及酶在β-N-乙酰氨基己糖苷化合物合成中的应用,以促进β-N-乙酰氨基己糖苷酶的进一步研究和开发应用。

关键词： β-N-乙酰氨基己糖苷酶催化机制生物学功能转糖基作用寡糖合成