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转录抑制共遏因子在肝癌中的表达及功能

中华实验外科杂志 2021年第2期38卷 336-338页

作者：张浩文陈松禹鹏飞赵栓柱刘攀付强胡明星秦涛郑州大学人民医院(河南省人民医院)肝胆胰腺外科 450003 河南省人民医院转化医学中心郑州450003

目的观察人转录抑制共遏因子(BCOR)在肝癌组织及对应癌旁组织中的表达和其对肝癌细胞增殖、迁移的影响。方法蛋白质印迹法(Western blot)检测BCOR在2019年8月至2020年10月在郑州大学人民医院接受手术切除的60例肝癌组织及对应癌旁组织... 详细信息

目的观察人转录抑制共遏因子(BCOR)在肝癌组织及对应癌旁组织中的表达和其对肝癌细胞增殖、迁移的影响。方法蛋白质印迹法(Western blot)检测BCOR在2019年8月至2020年10月在郑州大学人民医院接受手术切除的60例肝癌组织及对应癌旁组织中的表达水平;将构建的BCOR过表达载体及空病毒载体,经慢病毒包装后稳定转染至肝癌细胞中,构成实验组与对照组,免疫印迹法检测其表达变化;细胞计数试剂盒(CCK-8)实验检测转染后肝癌细胞增殖能力;划痕实验检测转染后肝癌细胞迁移能力;Transwell实验检测转染后肝癌细胞侵袭能力。两组之间比较采用t检验。结果癌旁组织中BCOR表达高于肝癌组织(1.316±0.642)倍,差异有统计学意义(t=2.689,P0.05)。24、48、72 h实验组A值(0.644±0.028、0.788±0.097、1.139±0.253)低于对照组(0.860±0.057、1.250±0.282、1.934±0.326),差异均有统计学意义(t=9.545、4.385、5.444,P抑制肝癌细胞的增殖、迁移能力。

关键词：实验组肝癌细胞增殖肝癌组织细胞数目转录抑制细胞计数免疫印迹法蛋白质印迹法

转录抑制LPL表达的ZHX2蛋白功能域的鉴定

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转录抑制LPL表达的ZHX2蛋白功能域的鉴定

作者：王唯山东大学

学位级别：硕士

ZHX2(zinc fingers and homoboxes 2),即锌指结构与同源结构域蛋白2,是一个转录抑制因子,与ZHX1、ZHX3组成锌指结构及同源结构域家族蛋白。研究发现,ZHX2在肝癌、肺癌、霍奇金淋巴瘤等多种恶性肿瘤疾病中表达下调,因此ZHX2被鉴定为一个... 详细信息

ZHX2(zinc fingers and homoboxes 2),即锌指结构与同源结构域蛋白2,是一个转录抑制因子,与ZHX1、ZHX3组成锌指结构及同源结构域家族蛋白。研究发现,ZHX2在肝癌、肺癌、霍奇金淋巴瘤等多种恶性肿瘤疾病中表达下调,因此ZHX2被鉴定为一个新的抑癌基因。此外,ZHX2尚可转录抑制肝癌细胞中重要的肿瘤标记物甲胎蛋白(AFP)、GPC3的表达,并通过调控细胞周期蛋白,抑制细胞的过度增殖,进一步说明ZHX2在抑制肿瘤发生和进程中起着重要作用,并为肝癌的诊断和预后监测提供了新的候选分子。与其他遗传背景相似的小鼠相比,Balb/cJ小鼠肝脏内的ZHX2表达水平显著降低,并可以避免高脂饮食饲喂诱导的高脂血症。通过数量性状位点图谱鉴定发现,脂质代谢相关基因LPL的表达水平与ZHX2表达水平呈现相反的表达趋势,这也许是因为饲喂高脂饮食后,Balb/cJ小鼠肝脏中高表达的LPL能摄取更多血浆甘油三酯,使血浆中甘油三酯的水平低于其他品系的小鼠。LPL全称脂蛋白脂肪酶,是机体分解甘油三酯的关键酶。LPL通过肝素结合位点以同源二聚体的形式锚定在血管内皮细胞表面,负责摄取载脂蛋白中的甘油三酯,供给需要能量的组织,如骨骼肌、心肌等;或将甘油三酯贮存在脂肪组织中。同ZHX2调控的另一个靶基因AFP类似,LPL也是一个在胚肝中高表达,在成人肝脏中低表达的基因。以上研究提示,ZHX2与LPL之间可能存在表达调控关系。我们实验室的前期工作表明,ZHX2可以结合到LPL启动子上,从转录水平抑制LPL的表达。ZHX2是一个多结构域的蛋白,全长837个氨基酸,分为两个锌指结构域和五个同源结构域,同源结构域1和同源结构域2之间有一个脯氨酸富含区。为进一步明确ZXH2转录抑制LPL表达的关键功能域,我们构建了不同长度ZHX2截短体的表达质粒,并研究其对LPL表达的抑制作用。研究目的1.构建包含不同功能域的ZHX2表达质粒,检测对LPL表达的影响,筛选出能抑制LPL表达的ZHX2蛋白功能域。2.检测全长或截短型ZHX2蛋白对LPL核心启动子活性的影响,进一步验证ZHX2关键功能域的转录抑制活性。研究方法1.截短型ZHX2表达载体的构建根据已有文献报道,ZHX2同源结构域4,5没有明确的抑制功能。本实验室之前已构建ZHX2锌指结构域1至同源结构域2(1-501aa)、同源结构域1至同源结构域2(242-501aa)、同源结构域1(242-338aa)三种截短体质粒。在此基础上,本课题进一步构建了ZHX2同源结构域1至部分脯氨酸富含区242-439aa(不含入核序列)及242-446aa(含入核序列)的截短体质粒,酶切和测序验证载体是否构建成功。2.抑制LPL-表达的ZHX2功能域的筛选在肝癌细胞系SMMC7721及HepG2中,转染ZHX2全长及各个截短体质粒。48小时后收RNA。RT-PCR检测LPL mRNA水平的变化。3.验证ZHX2对LPL核心启动子的调控作用将LPL核心启动子报告质粒分别与ZHX2全长及上述筛选出的、抑制LPL表达的ZHX2功能域过表达质粒共转入HEK293细胞中,以pRL-TK质粒为内参。48小时后收蛋白,双荧光检测ZHX2对LPL核心启动子的影响。研究结果1.截短型ZHX2表达质粒的构建和验证以pcDNA3质粒为骨架,在多克隆位点处的酶切位点EcoR I与Kpn Ⅰ之间插入编码不同长度ZHX2截短体ZHX2(242-439aa). ZHX2(242-446aa)的序列,T4连接酶连接粘性末端处的缺口,双酶切实验初步验证载体构建成功,最后测序确保构建载体的正确性。2. ZHX2(242-446aa)是转录抑制LPL表达的较小功能域在肝癌细胞系SMMC7721及HepG2中过表达ZHX2全长及包含不同功能域的截短体质粒,RT-PCR结果表明,与pcDNA3对照组相比,除了ZHX2全长的质粒具有抑制LPL表达的功能外,含锌指结构域1至同源结构域2(1-501aa)、同源结构域1至同源结构域2(242-501aa)、同源结构域1及部分脯氨酸富含区(242-446aa,含入核序列)区域仍有抑制功能;但同源结构域1至部分脯氨酸富含区(242-439aa,不含入核序列)及同源结构域1(242-338aa)的截短体质粒抑制功能消失。因此,ZHX2(242-446aa)是转录抑制表达的较小功能区。3. ZHX2(242-446aa)可抑制LPL核心启动子的活性将ZHX2全长或242-446aa片段的表达质粒与LPL核心启动子(-197～+96)共同转染入HEK293细胞中,双荧光素酶实验检测启动子活性。结果显示,与对照组相比,ZHX2(242-446aa)区域及ZHX2全长对于LPL的核心启动子均有抑制作用,进一步证实了ZHX2(242-446aa)对LPL表达的转录抑制作用。研究结论与意义：1.ZHX2可以从转录水平抑制LP

关键词： ZHX2 LPL 转录抑制功能区急性肝炎巨噬细胞

组蛋白H3K4去甲基化酶AOF1及其酶活性非依赖的转录抑制功能

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组蛋白H3K4去甲基化酶AOF1及其酶活性非依赖的转录抑制功能

作者：杨泽华东师范大学

学位级别：硕士

LSD1依据新的命名法为KDM1)作为第一个鉴定的组蛋白去甲基化酶,主要特异的作用于赖氨酸,属于四羟酮醇依赖型氨基酸氧化酶家族。我们在这里所报道的AOF1(依据新的命名法为KDM1B),是哺乳动物体内同LSD1相似的蛋白,其同样具有组蛋白H3K4mel... 详细信息

LSD1依据新的命名法为KDM1)作为第一个鉴定的组蛋白去甲基化酶,主要特异的作用于赖氨酸,属于四羟酮醇依赖型氨基酸氧化酶家族。我们在这里所报道的AOF1(依据新的命名法为KDM1B),是哺乳动物体内同LSD1相似的蛋白,其同样具有组蛋白H3K4mel and H3K4me2位点特异的去甲基化酶活性。和LSD1相似的是,其高度保守的SWIRM结构域是其酶活性所必需的。然而AOF1存在着与LSD1质不同的几个方面。首先,AOF1不与组蛋白去乙酰化酶共同形成稳定的复合体;其次,AOF1在细胞周期中的分裂期定位于染色体上,而LSD1并不存在同样的定位关系;此外,当AOF1与DNA结合时可以抑制转录,而这种转录抑制的功能是独立于其去甲基化酶活性的。通过结构和功能的分析,我们鉴定出AOF1的氮末端的Zf-CW结构域是其转录抑制功能所必需的。总的来讲：我们的研究鉴定了AOF1作为四羟酮醇依赖型氨基酸氧化酶家族第二个组蛋白去甲基化酶,并且揭示了其去甲基化酶活性非依赖的转录抑制功能。

关键词： AOF1 组蛋白 H3K4去甲基化酶染色质转录抑制 Zf-CW结构域

Olig2的转录抑制功能是少突胶质细胞分化所必需的

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Olig2的转录抑制功能是少突胶质细胞分化所必需的

作者：袁心悦厦门大学

学位级别：硕士

少突胶质细胞的分化发育过程可大致分为两个阶段:一是从少突胶质细胞前体细胞（OPC）开始的早期的定向分化初步形成未成熟的少突胶质细胞（iOL）;二是由iOL向彻底成熟的少突胶质细胞（mOL）演变的晚期定向分化阶段。整个过程历经了各种... 详细信息

少突胶质细胞的分化发育过程可大致分为两个阶段:一是从少突胶质细胞前体细胞（OPC）开始的早期的定向分化初步形成未成熟的少突胶质细胞（iOL）;二是由iOL向彻底成熟的少突胶质细胞（mOL）演变的晚期定向分化阶段。整个过程历经了各种经典形态功能的演变并且受到了多种重要作用因子的共同调控。其中少突胶质细胞的转录调控因子-2（Olig2）就是OPC细胞定向分化早期的核心转录因子,但其确切的作用和精准的调控机制还有待进一步探讨解决。核心转录因子往往在细胞的发育过程中起着多重的调节作用。而以往的相关研究主要都围绕着Olig2的转录激活功能展开,着重揭露了 Olig2可以通过转录激活的作用来调控OL的分化。关于Olig2的转录抑制作用,仅在运动神经元中有所发现。刚好其他研究人员有发表过Olig2在OL中的ChIP-seq[69]和RNA-seq[70]数据,于是我们对这些数据进行联合分析,结果发现Olig2结合的基因在OPC分化后有一半都出现表达量的下调。我们猜测,Olig2在少突胶质细胞发育过程中有发挥转录抑制活性。因此本实验对Olig2在OL分化过程中是否行使了转录抑制功能展开探索,证明这种转录抑制作用是否时少突胶质细胞发育所必需的。本实验主要通过构建重组质粒将VP64（转录因子增强结构域）和Olig2融合表达,将Olig2改造为完全转录激活状态的Olig2-VP64。以此为基础构建了相应的过表达载体,并包装相应的逆转录病毒,尝试了多种逆转录病毒包装条件并进行条件优化,建立高滴度的逆转录病毒感染系统。分别展开了体外OPC瞬时电转和逆转录病毒脑定位注射发育期小鼠大脑的实验,追踪实验组和对照组分化能力的差异。结果发现感染Olig2-VP64的OPC细胞与对照组感染Olig2的细胞,无论从形态、mRNA水平还是蛋白水平都表现出分化不完全的现象;而感染逆转录病毒的小鼠大脑皮层中的OPC同样也表现为分化受阻。由此可初步证明Olig2的转录抑制功能在OPC的发育分化过程中同样起到重要的调控作用,为后续更加精准细致的分子机制研究发展提供了崭新的思路和有力的证据。

关键词： Olig2 少突胶质细胞转录抑制逆转录病毒

PHF1参与基因转录抑制进而促进乳腺癌的发生及转移

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PHF1参与基因转录抑制进而促进乳腺癌的发生及转移

作者：刘瑞琼山东大学

学位级别：硕士

PHF1(PHD finger protein1)是由位于人类染色体6p21.3上的PHFl基因编码的蛋白质,由567个氨基酸组成,因含特征性的PHD (plant homeodomain)锌指结构域而得名,现已发现其与果蝇PCL具有同源性。PCL在哺乳动物中存在三个同源物,分别是PHF1, ... 详细信息

PHF1(PHD finger protein1)是由位于人类染色体6p21.3上的PHFl基因编码的蛋白质,由567个氨基酸组成,因含特征性的PHD (plant homeodomain)锌指结构域而得名,现已发现其与果蝇PCL具有同源性。PCL在哺乳动物中存在三个同源物,分别是PHF1, MTF2和PHF19。他们的共同特征为都含有一个TUDOR结构域和两个串联排列的PHD锌指结构域。虽然PHF1不具有酶活性,但由于这些特征性的识别结构域的存在,使得PHF1成为表观遗传调控中重要的解读者(reader)。研究发现,PHF1能够与PRC2复合物相互作用,进而影响组蛋白H3K27的甲基化状态和HOX基因的转录抑制。另外,PHF1可以通过其TUDOR结构域识别三甲基化的H3K36以及三甲基化的H3tK27,由此证明PHF1可能在多种组蛋白密码识别中都发挥着重要的作用。本研究发现PHF1与NuRD复合物,SIN3A复合物,CRL4B复合物,p160家族以及PRMT5/MEP50复合体在体内都存在相互作用,并可以转录抑制FBXW7的表达。另外,PHF1可以促进乳腺癌细胞的生长,侵袭和转移。我们的研究发现了PHF1新的参与转录调控的方式,进一步探明了其在肿瘤发生发展中的作用,为肿瘤尤其是乳腺癌的临床诊断和治疗提供了新的靶点。为了寻找PHF1在体内相互作用的其他蛋白,我们通过免疫亲和纯化和银染质谱测序的方式对与PHF1结合的蛋白进行了分析,发现了与PHF1相互作用的与表观遗传调控密切相关的蛋白有AIB1, EZH2, SUZ12, MTA1, PRMT5, HDAC2, MEP50以及EED等。我们通过免疫共沉淀(IP)的方法进行了证实。结果显示PHF1可与NuRD复合物,SIN3A复合物,PRMT5/MEP50复合物,CRL4B复合物以及p160家族等多种转录调控复合物相互作用。为进一步研究PHF1在转录调控中的作用,我们接下来用ChIP-on-chip芯片的方法分析PHF1参与调控的靶基因。结果发现PHF1可能调控的703个基因涉及Ras, MAPK, PI3K-Akt, Jak-STAT,细胞因子以及肿瘤通路等多个重要的细胞信号通路。我们通过ChIP方法进行验证,发现PHF1在CBX4, CTNNA1, E-cadherin, ERα, FBXW7, GATA5, ING3, POU1F1, SMAD7, SIAH2等基因的启动子上存在富集。我们进一步从中选取了与肿瘤发生发展密切相关的FBXW7作为靶基因进行进一步深入研究,发现PHF1不仅可以直接结合在FBXW7的启动子上,也可以转录抑制FBXW7的表达。为了探明PHF1对肿瘤发生发展的影响及其生物学意义,我们通过细胞生长曲线,克隆形成实验和转移小室实验等方法研究了PHF1在乳腺癌发生发展中的作用。研究发现PHF1能够促进乳腺癌细胞增殖生长,促进其EMT进程和侵袭转移。综上所述,我们发现了PHF1可以与多种转录调控复合物相互作用,通过转录抑制基因表达影响诸多细胞重要的信号通路,并通过转录抑制FBXW7的表达进而促进乳腺癌的增殖和转移。这些发现都有助于我们进一步深入理解和探讨PHF1在表观遗传调控中的作用机制及其在肿瘤发生发展中的作用。

关键词： PHF1 转录抑制 FBXW7 乳腺癌 EMT

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阴离子卟啉对DNA转录和端粒酶抑制的研究

中北大学学报（自然科学版） 2009年第4期30卷 354-358页

作者：翟保评忻州师范学院化学系山西忻州034000

新型抗肿瘤药物的设计是当今化学生物学中发展迅速且具有挑战性的研究领域之一,阴离子卟啉有着比阳离子卟啉更好的膜通透性.利用合成的阴离子卟啉化合物1,2和3,通过凝胶电泳和端粒酶重复序列扩增法(TRAP),研究了药物对DNA转录成为RNA和... 详细信息

新型抗肿瘤药物的设计是当今化学生物学中发展迅速且具有挑战性的研究领域之一,阴离子卟啉有着比阳离子卟啉更好的膜通透性.利用合成的阴离子卟啉化合物1,2和3,通过凝胶电泳和端粒酶重复序列扩增法(TRAP),研究了药物对DNA转录成为RNA和它们对端粒酶的抑制作用.实验结果表明:阴离子卟啉化合物1,2和3均可抑制DNA的转录和端粒酶的活性,其中化合物2的抑制作用尤为显著,其完全抑制的浓度分别为5μmol/L和3μmol/L,这与化合物2β-位所连8个强拉电子的溴原子所导致的整个分子的缺电子性有关.

关键词：阴离子卟啉转录抑制端粒酶重复序列扩增法端粒酶抑制

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DNA甲基化的3种可能转录抑制机制

生命的化学 2002年第1期22卷 35-36页

作者：刘泽军前川真人等滨松医科大学临床检查医学日本滨松

尽管DNA甲基化能抑制转录这一观点早已为人所知，但其精确的机制还不完全清楚~[1]。到目前为止，有3种可能的机制被用来解释甲基化的转录抑制过程。

关键词： DNA甲基化转录抑制转录阻遏物机制

恶性疟原虫重复散布家族基因转录调控的研究进展

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2023年第3期41卷 374-379页

作者：徐少杰陈绅波陈军虎中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所(国家热带病研究中心) 世界卫生组织热带病合作中心科技部国家级热带病国际联合研究中心国家卫生健康委员会寄生虫病原与媒介生物学重点实验室上海200025

恶性疟原虫在人体内编码变异型表面抗原,可能引起其对人体进行免疫逃避。重复散布家族(rif)基因是编码变异型表面抗原的第一大家族,研究rif基因的调控如组蛋白修饰、阻遏元件调节、表达蛋白参与了免疫逃避等,具有很重要的意义。本文对调... 详细信息

恶性疟原虫在人体内编码变异型表面抗原,可能引起其对人体进行免疫逃避。重复散布家族(rif)基因是编码变异型表面抗原的第一大家族,研究rif基因的调控如组蛋白修饰、阻遏元件调节、表达蛋白参与了免疫逃避等,具有很重要的意义。本文对调控rif基因机制的相关的研究进展进行综述,以期探究恶性疟原虫的致病过程。

关键词：恶性疟原虫 rif基因转录调控免疫逃避转录抑制

COX-2转录抑制作用逆转MDR1/P-gp介导卵巢癌紫杉醇耐药的研究

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COX-2转录抑制作用逆转MDR1/P-gp介导卵巢癌紫杉醇耐药的研究

作者：马雪莲广西医科大学

学位级别：硕士

背景与目的:卵巢癌的耐药已成为临床治疗失败的主要原因。环氧化酶-2(COX-2)过表达与肿瘤的发生和发展、多药耐药(Multi-drug resistance, MDR)形成、血管生成和侵袭转移等密切相关。转基因研究显示,COX-2参与了MDR1/P-gp表达的调节。CO... 详细信息

背景与目的:卵巢癌的耐药已成为临床治疗失败的主要原因。环氧化酶-2(COX-2)过表达与肿瘤的发生和发展、多药耐药(Multi-drug resistance, MDR)形成、血管生成和侵袭转移等密切相关。转基因研究显示,COX-2参与了MDR1/P-gp表达的调节。COX-2和MDR1/P-gp表达的增加与卵巢癌的化疗耐受和预后差密切相关。紫杉醇诱导COX-2的稳定表达和MDR1的过表达与卵巢癌细胞MDR形成和紫杉醇耐药有关。临床免疫组化的证据显示,卵巢癌存在COX-2和MDR1/P-gp共表达现象,高表达COX–2的上皮性卵巢癌有较高的MDR1/P-gp表达,通常对化疗反应不佳,且无进展期较短,但卵巢癌COX-2和MDR1/P-gp共表达是否存在依赖关系尚未阐明;现有的COX-2选择性抑制剂具有下调肿瘤细胞MDR1/P-gp表达的作用。但大多是COX-2非依赖性的。因此,卵巢癌COX-2过表达是否与MDR1/P-gp介导的紫杉醇耐药有关仍需进一步研究。本文旨在从抑制COX-2转录活性,探讨卵巢癌细胞COX-2与MDR1/P-gp表达的依赖关系,以及对紫杉醇敏感性的影响,从而为避免或逆转COX-2依赖的MDR1/P-gp介导的紫杉醇耐药提供一个新的化疗策略。方法:1.利用COX-2促进子抑制剂槲皮素(Quercetin)处理人卵巢癌紫杉醇耐药细胞株A2780/PTX,逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)检测A2780/PTX细胞的COX-2和MDR1 mRNA表达水平;2.用免疫细胞化学染色法和酶联免疫吸附试验(Elisa)检测A2780/PTX细胞P-gp的表达;3.用MTT法测定COX-2促进子抑制剂增加紫杉醇对A2780/PTX的生长抑制作用和敏感性。结果:1. RT-PCR分析显示,卵巢癌紫杉醇耐药细胞A2780/PTX存在COX-2和MDR1过表达;COX-2转录抑制明显下调A2780/PTX细胞的COX-2和MDR1 mRNA表达,与对照相比,P转录抑制48h后,随着药物浓度的增加,细胞膜及细胞浆棕色逐渐淡染,可见,A2780/PTX细胞P-gp蛋白表达呈浓度依赖性减弱;与未处理A2780/PTX细胞比较,有显著差异;酶联免疫吸附试验定量检测了不同浓度Qu(Quercetin)处理48h的A2780/PTX细胞MDR1/P-gp蛋白的表达情况,结果显示,与对照相比,Qu(50,100和200μmol/L)显著下调了MDR1/P-gp蛋白的表达,P转录抑制下调了MDR1/P-gp蛋白的表达, 3.COX-2转录抑制显著增加了紫杉醇对A2780/PTX细胞的生长抑制作用和敏感性,且呈明显的浓度依赖关系;不同浓度COX-2转录抑制剂(15μmol/L、30μmol/L)分别处理A2780/PTX细胞后,紫杉醇作用A2780/PTX细胞的IC50分别为2.114±0.122μmol/L、0.778±0.037μmol/L,与对照3.295±0.085μmol/L相比,其耐药指数ID(IC50 test/ IC50 contl)分别为0.64和0.24,分别降低了1.56和4.17倍(P转录抑制可明显下调MDR1/P-gp介导的MDR和增加A2780/PTX细胞对紫杉醇的敏感性,提示A2780/PTX细胞MDR表型与COX-2的过表达存在一定的依赖关系,通过COX-2转录抑制,下调COX-2依赖的MDR1/P-gp表达可能与增加紫杉醇敏感性有关。COX-2基因可能成为调控A2780/PTX细胞MDR1/P-gp表达的重要靶标。

关键词： COX-2 MDR1/P-gp 转录抑制卵巢癌耐药紫杉醇