转录抑制LPL表达的ZHX2蛋白功能域的鉴定

作     者：王唯 

作者单位：山东大学 

学位级别：硕士

导师姓名：梁晓红

授予年度：2015年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：ZHX2 LPL 转录抑制 功能区 急性肝炎 巨噬细胞 

摘      要：ZHX2(zinc fingers and homoboxes 2),即锌指结构与同源结构域蛋白2,是一个转录抑制因子,与ZHX1、ZHX3组成锌指结构及同源结构域家族蛋白。研究发现,ZHX2在肝癌、肺癌、霍奇金淋巴瘤等多种恶性肿瘤疾病中表达下调,因此ZHX2被鉴定为一个新的抑癌基因。此外,ZHX2尚可转录抑制肝癌细胞中重要的肿瘤标记物甲胎蛋白(AFP)、GPC3的表达,并通过调控细胞周期蛋白,抑制细胞的过度增殖,进一步说明ZHX2在抑制肿瘤发生和进程中起着重要作用,并为肝癌的诊断和预后监测提供了新的候选分子。与其他遗传背景相似的小鼠相比,Balb/cJ小鼠肝脏内的ZHX2表达水平显著降低,并可以避免高脂饮食饲喂诱导的高脂血症。通过数量性状位点图谱鉴定发现,脂质代谢相关基因LPL的表达水平与ZHX2表达水平呈现相反的表达趋势,这也许是因为饲喂高脂饮食后,Balb/cJ小鼠肝脏中高表达的LPL能摄取更多血浆甘油三酯,使血浆中甘油三酯的水平低于其他品系的小鼠。LPL全称脂蛋白脂肪酶,是机体分解甘油三酯的关键酶。LPL通过肝素结合位点以同源二聚体的形式锚定在血管内皮细胞表面,负责摄取载脂蛋白中的甘油三酯,供给需要能量的组织,如骨骼肌、心肌等;或将甘油三酯贮存在脂肪组织中。同ZHX2调控的另一个靶基因AFP类似,LPL也是一个在胚肝中高表达,在成人肝脏中低表达的基因。以上研究提示,ZHX2与LPL之间可能存在表达调控关系。我们实验室的前期工作表明,ZHX2可以结合到LPL启动子上,从转录水平抑制LPL的表达。ZHX2是一个多结构域的蛋白,全长837个氨基酸,分为两个锌指结构域和五个同源结构域,同源结构域1和同源结构域2之间有一个脯氨酸富含区。为进一步明确ZXH2转录抑制LPL表达的关键功能域,我们构建了不同长度ZHX2截短体的表达质粒,并研究其对LPL表达的抑制作用。研究目的1.构建包含不同功能域的ZHX2表达质粒,检测对LPL表达的影响,筛选出能抑制LPL表达的ZHX2蛋白功能域。2.检测全长或截短型ZHX2蛋白对LPL核心启动子活性的影响,进一步验证ZHX2关键功能域的转录抑制活性。研究方法1.截短型ZHX2表达载体的构建根据已有文献报道,ZHX2同源结构域4,5没有明确的抑制功能。本实验室之前已构建ZHX2锌指结构域1至同源结构域2(1-501aa)、同源结构域1至同源结构域2(242-501aa)、同源结构域1(242-338aa)三种截短体质粒。在此基础上,本课题进一步构建了ZHX2同源结构域1至部分脯氨酸富含区242-439aa(不含入核序列)及242-446aa(含入核序列)的截短体质粒,酶切和测序验证载体是否构建成功。2.抑制LPL-表达的ZHX2功能域的筛选在肝癌细胞系SMMC7721及HepG2中,转染ZHX2全长及各个截短体质粒。48小时后收RNA。RT-PCR检测LPL mRNA水平的变化。3.验证ZHX2对LPL核心启动子的调控作用将LPL核心启动子报告质粒分别与ZHX2全长及上述筛选出的、抑制LPL表达的ZHX2功能域过表达质粒共转入HEK293细胞中,以pRL-TK质粒为内参。48小时后收蛋白,双荧光检测ZHX2对LPL核心启动子的影响。研究结果1.截短型ZHX2表达质粒的构建和验证以pcDNA3质粒为骨架,在多克隆位点处的酶切位点EcoR I与Kpn Ⅰ之间插入编码不同长度ZHX2截短体ZHX2(242-439aa). ZHX2(242-446aa)的序列,T4连接酶连接粘性末端处的缺口,双酶切实验初步验证载体构建成功,最后测序确保构建载体的正确性。2. ZHX2(242-446aa)是转录抑制LPL表达的较小功能域在肝癌细胞系SMMC7721及HepG2中过表达ZHX2全长及包含不同功能域的截短体质粒,RT-PCR结果表明,与pcDNA3对照组相比,除了ZHX2全长的质粒具有抑制LPL表达的功能外,含锌指结构域1至同源结构域2(1-501aa)、同源结构域1至同源结构域2(242-501aa)、同源结构域1及部分脯氨酸富含区(242-446aa,含入核序列)区域仍有抑制功能;但同源结构域1至部分脯氨酸富含区(242-439aa,不含入核序列)及同源结构域1(242-338aa)的截短体质粒抑制功能消失。因此,ZHX2(242-446aa)是转录抑制表达的较小功能区。3. ZHX2(242-446aa)可抑制LPL核心启动子的活性将ZHX2全长或242-446aa片段的表达质粒与LPL核心启动子(-197～+96)共同转染入HEK293细胞中,双荧光素酶实验检测启动子活性。结果显示,与对照组相比,ZHX2(242-446aa)区域及ZHX2全长对于LPL的核心启动子均有抑制作用,进一步证实了ZHX2(2