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转基因植物检测基因芯片在上海诞生

长江蔬菜 2003年第1期 52-52页

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基因芯片检测转基因植物方法学的建立

基因芯片检测转基因植物方法学的建立

作者：高秀丽中国科学院研究生院（上海微系统与信息技术研究所）

学位级别：硕士

转基因技术的发展给人们的生活带来了更多的机遇。通过生物技术可使品种改良如产量增加、品质提高、抗性(抗虫、抗旱、抗病、抗逆)增强等，但200多年来的工业文明告诉人类，科学是一把双刃剑，在给人类带来无限益处的同时，也引起了人... 详细信息

转基因技术的发展给人们的生活带来了更多的机遇。通过生物技术可使品种改良如产量增加、品质提高、抗性(抗虫、抗旱、抗病、抗逆)增强等，但200多年来的工业文明告诉人类，科学是一把双刃剑，在给人类带来无限益处的同时，也引起了人们的担忧。从转基因技术诞生至今，人类一直进行着有关转基因技术的食品安全、环境风险、生态安全、社会伦理道德以及国际经济和政治安全等一系列问题的思考及争论。因此，转基因植物的检测的愈发重要，只有准确地检测转基因食品，才能有效的对上市的转基因食品进行监控。本论文建立了用基因芯片检测转基因植物的方法，利用基因芯片信息量大的特点，能同时对转基因植物中的启动子、终止子、报告基因进行检测。和PCR这些传统检测转基因植物的方法相比，具有灵敏度高、特异性高，操作简便、快速，自动化程度高及结果准确率高等特点。和以往基于杂交检测原理的基因芯片不同，我们探讨了基于引物延伸原理的芯片检测方法。利用此种基因芯片对转基因样品进行检测，能够实现样品扩增、标记、检测的一体化，大大缩短了检测时间，也为目前基因芯片中大片段待测样品和小片段探针杂交的技术难题提供了一种新的思路。我们利用此种芯片实现了对质粒pCAMBIA1301中所含的四个基因GUS、35S启动子、hpt、aadA的特异性同步检测。我们还讨论了利用微测序基因芯片来检测转基因植物，基于微测序检测原理的基因芯片，不仅通过探针和目的片段杂交时的热稳定性来区分样品，还利用了DNA聚合酶的特异性延伸来对样品进行检测，因此理论上具有更高的特异性。我们初步利用质粒pCAMBIA1301中GUS、35S启动子、hpt、aadA基因的PCR产物作为检测的对象，实现对这几个基因的特异性检测，为以后直接利用质粒或基因组DNA作为检测对象奠定了基础。通过本论文的研究表明，基因芯片是一种可行有效的转基因植物检测方法，具有广阔的应用前景。

关键词：转基因植物检测基因芯片引物延伸芯片微测序芯片

超低温11年保存期对转基因作物基体标准样品核酸检测的影响

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作物学报 2022年第1期48卷 238-248页

作者：王渭霞赖凤香胡海燕何佳春魏琪万品俊傅强中国水稻研究所浙江杭州310006

标准物质是转基因检测结果可靠性、可比性以及准确性的重要参比,不可缺少。本文研究了植物转基因成分检测中基体标准物质的长期保存对PCR检出及低含量标准物质量值稳定性的影响。应用普通定性PCR、实时荧光PCR和微滴式数字PCR 3种方法,... 详细信息

标准物质是转基因检测结果可靠性、可比性以及准确性的重要参比,不可缺少。本文研究了植物转基因成分检测中基体标准物质的长期保存对PCR检出及低含量标准物质量值稳定性的影响。应用普通定性PCR、实时荧光PCR和微滴式数字PCR 3种方法,对不同含量转基因标准物质和转基因检测样品进行了复现性和量值稳定检测。结果表明,-70~-75℃保存条件下,9年保存期的转基因含量为0.1%的单一作物转化体标准物质中依然能得到清晰的转化体目标片段扩增,且Ct值在36左右。数字PCR定值结果表明,9年保存期的转基因基体标准物质的量值保持稳定。11年保存期的大豆、玉米、水稻的混合基体样品中各转基因元件均能稳定检出。研究结果表明转基因基体标准物质的长期低温保存不会影响其各转基因元件的检出和作为转基因核酸检测阳性对照的应用。

关键词：转基因生物基体标准物质转基因植物检测标准物质保存

甘露糖筛选体系及在转基因玉米商业化中的应用

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生物技术通报 2014年第9期30卷 13-21页

作者：刘戬丰王艳丽李相敢先正达生物科技(中国)有限公司北京102206

甘露糖在己糖激酶的作用下形成6-磷酸甘露糖,进一步在磷酸甘露糖异构酶(Phosphomannose isomerase,PMI)的催化下转化成植物可利用的6-磷酸果糖,从而使转化细胞在甘露糖作为主要碳源的培养基上正常生长,而非转化细胞生长受到抑制。这一... 详细信息

甘露糖在己糖激酶的作用下形成6-磷酸甘露糖,进一步在磷酸甘露糖异构酶(Phosphomannose isomerase,PMI)的催化下转化成植物可利用的6-磷酸果糖,从而使转化细胞在甘露糖作为主要碳源的培养基上正常生长,而非转化细胞生长受到抑制。这一筛选体系被认为是一种正向筛选(Positive selection),已被成功地应用于重要的粮食作物和经济作物中。甘露糖筛选的植株可以通过多种方法检测,其中氯酚红检测法和试纸条检测法简单方便,适用于初步筛选。甘露糖筛选体系安全高效,已被应用于玉米商业化产品中。综述了甘露糖(mannose)筛选体系的原理、筛选特点、植株的鉴定、筛选方法的优缺点以及在商业化中的应用,列举了利用甘露糖筛选的玉米单性状转化系用于抗鳞翅目和抗鞘翅目昆虫及抗高温淀粉酶的范例及其在育种叠加中的应用。这种育种叠加使得甘露糖筛选的性状与其他性状重叠而得到更广谱的具有抗除草剂抗虫性状的商业化产品。

关键词：磷酸甘露糖异构酶筛选标记安全性分析转基因植物检测甘露糖

用引物延伸芯片法实现对转基因水稻中质粒pCAMBIA1301的检测

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遗传 2005年第2期27卷 271-278页

作者：高秀丽杨剑波景奉香赵建龙中国科学院上海微系统与信息技术研究所上海200050 安徽省农业科学院合肥230031

生物芯片技术是生物技术和微制造技术的融合, 已广泛用于生命科学的研究及实践、医学科研及临床、药物设计、环境保护、农业、军事等各个领域。而基因芯片是生物芯片中的一种,是指将大量基因探针分子固定于支持物上,然后与标记的样品进... 详细信息

生物芯片技术是生物技术和微制造技术的融合, 已广泛用于生命科学的研究及实践、医学科研及临床、药物设计、环境保护、农业、军事等各个领域。而基因芯片是生物芯片中的一种,是指将大量基因探针分子固定于支持物上,然后与标记的样品进行杂交,所以一次可对大量核酸分子进行检测分析,从而解决了传统核酸印迹杂交技术操作复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少、效率低等不足。文章探讨了用基因芯片这一新的检测手段对转基因植物的初步检测,采用一种新的反应机制-引物延伸芯片法(arrayed primer extension),实现了样品扩增和杂交的一步化,而在传统的基因芯片检测中要需要两步来完成,从而为目前基因芯片中大片段样品的检测提供了一种可能性。

关键词：生物芯片基因芯片转基因植物检测引物延伸芯片法

拟南芥胱硫醚-γ-合成酶（D-AtCGS）基因在大肠杆菌中的表达及抗血清制备

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拟南芥胱硫醚-γ-合成酶（D-AtCGS）基因在大肠杆菌中的表达及抗...

作者：王义鹏东北林业大学

学位级别：硕士

蛋氨酸作为含硫必需氨基酸,具有重要的生理功能。它不仅是蛋白质的构成成分,而且是mRNA翻译的起始氨基酸。其下游产物硫腺苷甲硫氨酸是生物体内最重要的甲基供体,同时还具有转硫、转氨丙基的作用;其衍生物硫甲基甲硫氨酸是重要的硫转运... 详细信息

蛋氨酸作为含硫必需氨基酸,具有重要的生理功能。它不仅是蛋白质的构成成分,而且是mRNA翻译的起始氨基酸。其下游产物硫腺苷甲硫氨酸是生物体内最重要的甲基供体,同时还具有转硫、转氨丙基的作用;其衍生物硫甲基甲硫氨酸是重要的硫转运分子,与生物硫代谢密切相关。蛋氨酸能促进动物身体及毛发生长,对肝脏有保护作用,并参与血球素的形成。缺乏时会引起食欲减退,体重迅速下降,还可引发脂肪肝、卵磷脂缺乏、毛发变质、肌肉萎缩和贫血等现象。人和非类反刍动物不能自身合成蛋氨酸,只能依靠日常膳食摄取,但目前主要作物的蛋氨酸含量普遍较低,大豆作为优质蛋白来源,蛋氨酸含量仅占种子总蛋白的1.1%-1.6%。现有大豆品种资源蛋氨酸含量遗传变异相当有限,给通过常规育种方法培育高蛋氨酸品种带来了很大限制,转基因技术的出现,为该问题的解决提供了新的途径。胱硫醚-Y-合成酶（Cystathionine-γ-synthase, CGS）是蛋氨酸合成的关键酶,它催化O-酸高丝氨酸（O-phospho-L-homoserine, OPH）形成胱硫醚,胱硫醚在胱硫醚-β-裂合酶、甲硫氨酸合成酶和S-腺苷甲硫氨酸合成酶的作用下,最终生成蛋氨酸。CGS与TS的Km值相近,对OPH的利用效率取决于这两种酶的含量。大量的研究表明CGS的表达受到底物的反馈抑制。因此,在利用基因工程手段进行调控时,需对CGS基因的分子结构进行改造,减少底物反馈抑制作用。对拟南芥CGS的研究表明.其N端99-128位的30个氨基酸与催化作用无关,将其删除后反馈抑制作用明显减弱,过量表达这种N端删除的CGS基因更利于培育蛋氨酸含量提高的转基因植物。本实验室用N端删除的AtCGS基因（D-AtCGS）转化大豆及豆科模式植物百脉根,进行蛋氨酸合成调控研究及高蛋氨酸大豆的分子育种,目前已成功获得了多个转基因株系。本实验以N端删除的AtCGS基因D-AtCGS为目的基因,构建原核表达载体,对D-AtCGS进行了原核表达,制备了抗血清,并利用制备的抗血清对本实验获得的多种转D-AtCGS基因大豆材料和都可模式植物百脉根进行了Western blot及ELISA检测,结果表明转基因植株的检测信号明显高于野生型对照,最终成功的建立了D-AtCGS转基因植物的免疫学检测方法,本研究可为植物CGS表达调控研究及大豆和其他作物的CGS转基因植株检测提供理想的技术支持。

关键词：蛋氨酸胱硫醚-γ-合成酶原核表达转基因植物检测

GNA单克隆抗体的制备及在检测GNA转基因大豆方面的应用

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GNA单克隆抗体的制备及在检测GNA转基因大豆方面的应用

作者：董春光东北师范大学

学位级别：硕士

雪花莲凝集素（GNA）是植物凝集素家族中非常重要的一员。GNA单体由109个氨基酸组成,分子量为12kDa,天然的GNA是一个由四个单体以非共价结合而形成的一个分子量为50kDa多聚体糖蛋白。GNA可以专一识别甘露糖,并通过破坏昆虫中肠的表皮细... 详细信息

雪花莲凝集素（GNA）是植物凝集素家族中非常重要的一员。GNA单体由109个氨基酸组成,分子量为12kDa,天然的GNA是一个由四个单体以非共价结合而形成的一个分子量为50kDa多聚体糖蛋白。GNA可以专一识别甘露糖,并通过破坏昆虫中肠的表皮细胞从而达到杀虫的目的。GNA对刺吸式口器的害虫和某些咀嚼式口器的害虫及多种线虫均有较好的毒杀效果,如蚜虫、稻飞虱、叶蝉等,可以部分弥补BT的杀虫图谱,近年来引起了科学家的广泛关注,越来越多种植物被转入了GNA的基因。随着转基因植物突飞猛进的发展,转基因植物以及转基因食品安全性的问题越来越受到人们的关注。本实验制备了抗GNA的单克隆抗体,并把它用于对GNA转基因大豆的检测。首先用从SIGMA公司购得的GNA纯品免疫BALB/c小鼠,每次8μg,共免疫4次。加强免疫后第四天取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合。融合率为5%,阳性率为20.8%。通过4次有限稀释克隆获得了一株抗GNA的杂交瘤细胞株,命名为2D8。以GNA纯品通过Western Blot法和间接ELISA法对单抗2D8进行检测,证明了单抗2D8确实是与GNA蛋白特异性结合的。用间接ELISA法测定腹水的效价为1:400。用改良的CTAB法提取GNA转基因大豆的基因组DNA,以根据GNA的全长序列设计的引物进行PCR反应,以非转基因大豆基因组作为阴性对照,证明了GNA转基因大豆中确实整合了GNA的基因。提取GNA转基因大豆的可溶性蛋白,用单抗2D8对其进行间接ELISA法检测,并以非转基因大豆的可溶性蛋白作为阴性对照,结果证明了GNA转基因大豆确实表达了GNA蛋白,并测得其表达的GNA蛋白占其可溶性蛋白的0.1%左右。进一步利用单抗2D8对GNA转基因大豆的可溶性蛋白进行了Western Blot法检测,同样以非转基因大豆的可溶性蛋白作为阴性对照,也在GNA转基因大豆中检测到了转入GNA基因的表达。这些结果都为我们建立一套可以在蛋白水平上,更快捷更准确的对转基因植物进行检测的方法提供了基础。

关键词：单克隆抗体转基因植物检测间接ELISA法 Western Blot法