GNA单克隆抗体的制备及在检测GNA转基因大豆方面的应用

作     者：董春光 

作者单位：东北师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王兴智

授予年度：2007年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 071007[理学-遗传学] 

主      题：单克隆抗体 转基因植物检测 间接ELISA法 Western Blot法 

摘      要：雪花莲凝集素（GNA）是植物凝集素家族中非常重要的一员。GNA单体由109个氨基酸组成,分子量为12kDa,天然的GNA是一个由四个单体以非共价结合而形成的一个分子量为50kDa多聚体糖蛋白。GNA可以专一识别甘露糖,并通过破坏昆虫中肠的表皮细胞从而达到杀虫的目的。GNA对刺吸式口器的害虫和某些咀嚼式口器的害虫及多种线虫均有较好的毒杀效果,如蚜虫、稻飞虱、叶蝉等,可以部分弥补BT的杀虫图谱,近年来引起了科学家的广泛关注,越来越多种植物被转入了GNA的基因。随着转基因植物突飞猛进的发展,转基因植物以及转基因食品安全性的问题越来越受到人们的关注。本实验制备了抗GNA的单克隆抗体,并把它用于对GNA转基因大豆的检测。 首先用从SIGMA公司购得的GNA纯品免疫BALB/c小鼠,每次8μg,共免疫4次。加强免疫后第四天取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合。融合率为5%,阳性率为20.8%。通过4次有限稀释克隆获得了一株抗GNA的杂交瘤细胞株,命名为2D8。以GNA纯品通过Western Blot法和间接ELISA法对单抗2D8进行检测,证明了单抗2D8确实是与GNA蛋白特异性结合的。用间接ELISA法测定腹水的效价为1:400。 用改良的CTAB法提取GNA转基因大豆的基因组DNA,以根据GNA的全长序列设计的引物进行PCR反应,以非转基因大豆基因组作为阴性对照,证明了GNA转基因大豆中确实整合了GNA的基因。 提取GNA转基因大豆的可溶性蛋白,用单抗2D8对其进行间接ELISA法检测,并以非转基因大豆的可溶性蛋白作为阴性对照,结果证明了GNA转基因大豆确实表达了GNA蛋白,并测得其表达的GNA蛋白占其可溶性蛋白的0.1%左右。进一步利用单抗2D8对GNA转基因大豆的可溶性蛋白进行了Western Blot法检测,同样以非转基因大豆的可溶性蛋白作为阴性对照,也在GNA转基因大豆中检测到了转入GNA基因的表达。 这些结果都为我们建立一套可以在蛋白水平上,更快捷更准确的对转基因植物进行检测的方法提供了基础。