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KRAS突变型肺腺癌患者组织中浸润性记忆b细胞的表达及相关基因研究

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KRAS突变型肺腺癌患者组织中浸润性记忆B细胞的表达及相关基因研究

作者：李瑛玮昆明医科大学

学位级别：硕士

[目的]探讨肺腺癌中KRAS突变状态与肿瘤浸润性记忆b细胞之间的联系,分析相关机制与共表达基因,及是否有作为预后标志物与免疫治疗预测标志物的可能性。[方法]1.生物信息学分析:（1）通过数据库中转录组测序数据将肺腺癌（Lung adenocar... 详细信息

[目的]探讨肺腺癌中KRAS突变状态与肿瘤浸润性记忆b细胞之间的联系,分析相关机制与共表达基因,及是否有作为预后标志物与免疫治疗预测标志物的可能性。[方法]1.生物信息学分析:（1）通过数据库中转录组测序数据将肺腺癌（Lung adenocarcinoma,LUAD）病例分为两组进行浸润性免疫细胞浸润分数的估算,选择含量较高、差异明显的记忆b细胞（Memory b cell,MbC）进行接下来的研究。通过对病例临床数据的统计分析,生存分析,了解Kirsten鼠类肉瘤病毒癌基因（Kirsten rat sarcoma viral oncogene,KRAS）突变与MbC浸润分数的临床意义及对病例预后的影响。（2）对分组的病例进行差异基因（The differentially expressed genes,DEGs）分析、通路富集分析与基因共表达分析,探讨MbC浸润分数与KRAS突变状态的联系。（3）通过DEGs建立风险评分模型,验证模型对MbC浸润分数及对预后情况的预测能力,并分析模型涉及单基因的预测能力。2.免疫荧光（Immunofluorescence,IF）双染验证MbC浸润情况:收集基因检测确诊为KRAS突变型及KRAS野生型的患者经手术切除的样本组织,使用肿瘤组织石蜡包埋切片（Formalin fixatio and paraffin embedding,FFPE）对MbC表面标志物CD19、CD27进行IF染色,计算MbC浸润分数,验证第一部分结果。3.分析所选基因细胞水平表达情况:使用两株KRAS突变型LUAD细胞株A549、NCI-H1734与一株KRAS野生型LUAD细胞株NCI-H1975,通过实时荧光定量PCR技术（Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR）在细胞水平对风险评分模型中的入选基因在各株细胞内表达差异进行比较。4.选择差异较大的基因进行生信分析:了解其与主要通路的相关性,探讨其与免疫检查点抑制剂治疗的相关性及对免疫治疗响应的预测能力。[结果]1.MbC浸润分数在KRAS突变型LUAD中显著降低（p＜0.05）,且其浸润分数的降低与病例的预后总生存期较差相关（p＜0.05）;男性病例的MbC浸润分数相较于女性更低。MbC浸润分数的高低、KRAS突变状态均与细胞粘附、胆固醇代谢、细胞分化周期等通路相关;使用DEGs建立的风险评分模型为:Riskscore=（0.2875）*GAR1+（0.136）*DNER+（-0.1311）*ATP7b+（0.0973）*IGFbP1+（0.2663）*GNPNAT1+（0.0646）*FAM83A,经过验证,该模型有良好的预测MbC浸润水平及预后能力。所涉及6个基因中的5个风险基因亦具有良好的单基因预测能力（p＜0.05）。2.IF双染验证了 KRAS突变型LUAD的MbC浸润分数低的结果。3.IGFbP1在携带KRAS突变的细胞株中均显著上调（p＜0.05）,FAM83A在携带KRAS突变的细胞株中均显著下调。4.两个基因表达的上调均导致了更差的预后;两个基因与细胞粘附通路显著相关;两个基因的表达均与CD8+T细胞的浸润分数负相关,且低表达FAM83A、IGFbP1的病例对免疫治疗的响应更好。[结论]1.KRAS的突变会导致肿瘤组织浸润性MbC浸润分数降低,两者均会导致较差的预后。KRAS突变型LUAD组织中MbC浸润分数的变化可能与细胞粘附、胆固醇代谢、细胞分化等过程相关;2.根据共表达基因所构建的风险评分模型对KRAS突变型LUAD患者的MbC浸润情况及预后情况有较准确的预测能力,为后续建立预后模型奠定了基础;3.FAM83A及IGFbP1可能是导致KRAS突变型患者MbC改变的关键基因,在LUAD患者中测定其表达可能有着重要的指导预后作用,低表达FAM83A、IGFbP1的病人可能更适于免疫检查点抑制剂治疗,FAM83A、IGFbP1可能作为免疫治疗预测标志物。

关键词：肺腺癌 KRAS突变肿瘤微环境记忆b细胞风险评分模型

HLA等位基因型及记忆b细胞的功能亚群与重症肌无力患者的相关性分析

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HLA等位基因型及记忆B细胞的功能亚群与重症肌无力患者的相关性分...

作者：马桠楠宁夏医科大学

学位级别：硕士

目的本研究旨在通过分析重症肌无力（myasthenia gravis,MG）患者T、b细胞亚群的分布及功能特点、寻找MG与人类白细胞抗原（human leukocyte antigen,HLA）等位基因之间的关联性以及筛选抗乙酰胆碱受体（acetylcholine receptor,ACh R... 详细信息

目的本研究旨在通过分析重症肌无力（myasthenia gravis,MG）患者T、b细胞亚群的分布及功能特点、寻找MG与人类白细胞抗原（human leukocyte antigen,HLA）等位基因之间的关联性以及筛选抗乙酰胆碱受体（acetylcholine receptor,ACh R）抗体的优势表位,以此为MG患者的诊断及治疗提供一定参考。方法收集符合纳入排除标准的MG患者以及健康对照者分为MG组和健康对照组。用流式细胞仪检测外周血中T细胞、b细胞亚群的分类及计数,为研究治疗方式对T、b细胞亚群表达水平的影响,将MG组进一步为分为常规治疗组和免疫抑制剂治疗组,并用统计学方法分析比较各组人群T、b细胞亚群表达水平的差异及其与MG的相关性。对MG组和健康对照组行HLA等位基因型测定,并用统计学方法分析MG与HLA等位基因间的关联性。使用生物信息学方法筛选可能的ACh R优势肽段。用酶联免疫斑点技术鉴定经人工合成ACh R肽段刺激后,各组人群外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PbMCs）中分泌免疫球蛋白1（immunoglobulin 1,Ig G1）的特异性b细胞的计数,并用统计学方法比较各组间特异性b细胞计数的差异。结果1.流式细胞术分析示各组间T细胞亚群比例及活化率均无统计学差异（均P>0.05）;免疫抑制剂治疗组b细胞表达水平低于常规治疗组（P记忆b细胞(memory b cells,b)表达水平高于免疫抑制剂治疗组（P记忆b细胞、类别转换记忆b细胞（switched memory b cells,SM b cells）、双阴性b细胞比例均高于健康对照组（均Pb细胞表达水平显著高于常规治疗组（Pb细胞表达水平低于免疫抑制剂治疗组（Pb细胞（r=0.845,Pb（r=0.822,Pb细胞（r=0.866,Pb细胞（r=-0.834,Pb（r=-0.875,Pb细胞（r=-0.903,Pb细胞表达水平与疾病严重程度减轻情况呈负相关（r=-0.798,P0.05）。4.经抗原肽分子对接模拟示ACh Rα88-96（NPDDYGGVK）肽段和ACh Rε88-98（SKDDFGGIETL）肽段为优势肽段。5.MG组PbMCs中分泌Ig G1的特异性b细胞计数明显高于健康对照组（PbMCs中分泌Ig G1的特异性b细胞计数高于经ACh Rε88-98肽段刺激的患者（P记忆b细胞、SM b细胞亚群存活和分化而减轻MG患者疾病严重程度并降低ACh R抗体滴度。2.动态监测记忆b细胞亚群在血液中的组成变化可以部分反映MG患者的治疗效果。3.线性ACh Rα88-96肽段较ACh Rε88-98肽段是抗ACh R抗体的优势表位。

关键词：重症肌无力 HLA等位基因记忆b细胞

检测PCV2特异性记忆b细胞的ELISpot方法建立及应用

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检测PCV2特异性记忆B细胞的ELISpot方法建立及应用

作者：范方程湖南农业大学

学位级别：硕士

猪圆环病毒2(porcine circovirus type-2,PCV2)是断奶仔猪多系统衰竭综合症(Post-weaning multisystem wasting syndrome,PMWS)、猪皮炎肾炎综合症(Porcine dermatitis and nephropathy syndrome,PDNS)等多种猪病的主要病原,PCV2在我国流行范围广,感染情况严重,对养猪业危害大。现阶段,疫苗免疫是预防猪圆环病毒病(Porcine circovirus disease,PCVD)的主要手段,因此对疫苗诱导的体液免疫反应的评估尤为重要。然而常规的抗体检测方法无法区分母源抗体、疫苗抗体和野毒感染抗体,加上PCV2疫苗的特性等各种因素的影响,我们难以客观的判断疫苗是否产生了明显的效果。本研究尝试从细胞水平来对PCV2疫苗免疫效果进行评价。通过从猪外周血中分离出原代淋巴细胞,并将淋巴细胞中的记忆b细胞刺激分化为抗体分泌细胞(antibody-secreting cells,ASCs),将其加入到包被Cap蛋白的ELISpot板孔中,利用Cap蛋白捕获特异性b细胞,后续分别加入生物素化二抗和HRP标记的链霉亲和素等,且优化各项反应条件,确定Cap蛋白的包被浓度为1.25μg/m L、生物素化二抗浓度为5μg/m L、HRP标记的链霉亲和素浓度为0.25μg/m L,成功建立了检测PCV2特异性记忆b细胞的ELISpot方法。将40头高母源抗体仔猪随机分为4组,分别注射三种不同品牌PCV2疫苗及生理盐水,通过ELISpot结合ELISA与荧光定量PCR方法,对免疫前后不同时期的体液抗体水平、体液免疫记忆水平及PCV2病毒血症的动态变化规律进行研究。ELISA结果表明各免疫组的PCV2抗体的消长规律均与注射生理盐水组极其相似,均一直处于下降的趋势;而ELISpot结果表明,相对于生理盐水组,三个疫苗免疫组在免疫后特异性记忆b细胞水平均有明显上升,并且疫苗A诱导的特异性记忆b细胞水平最高,其次分别为疫苗b和疫苗C;定量PCR检测结果表明,疫苗A、疫苗b、疫苗C及对照组的PCV2感染率分别为:11.1%、10%、44.4%、44.4%。以上研究表明:在有母源抗体存在的情况下,利用ELISpot检测PCV2特异性记忆b细胞水平,能够较好的反映疫苗的体液免疫水平及抵抗PCV2感染的效果,该方法可以用于PCV2疫苗免疫效果评价,对PCV2的防控具有重要意义。

关键词：猪圆环病毒2型记忆b细胞 ELISpot 疫苗免疫记忆

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记忆b细胞能否分泌抗体

生物学教学 2018年第11期43卷 65-66页

作者：黎文妍王任翔陈国娟黄爱琼广西师范大学生命科学学院桂林541004

通过梳理b细胞的分化过程,明确体液免疫中发挥效应作用的是游离在血清中的分泌型抗体,这是由b细胞的终末细胞——浆细胞所分泌的。记忆细胞仅具有膜抗体,必须分化为浆细胞,由浆细胞分泌抗体,才能介导二次免疫应答。

关键词：记忆b细胞浆细胞抗体

TLR7/8激动剂R848体外诱导记忆b细胞分化抗原特异性浆细胞的方法研究

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免疫学杂志 2020年第7期36卷 553-561页

作者：程婕刘晔孙欣黄晶晶金艾顺重庆医科大学基础医学院免疫学教研室 400016 肿瘤免疫基础与转化重庆市重点实验室 400016 哈尔滨医科大学基础医学院免疫学教研室 150086

目的为了从PbMCs获得病原体特异性浆细胞,我们建立了TLR7/8激动剂R848体外诱导记忆b淋巴细胞分化浆细胞的方法。方法使用TLR7/8激动剂R848联合细胞因子组合,诱导接种乙肝疫苗(3年及以上)的健康志愿者来源的PbMCs,进行体外活化和分化浆... 详细信息

目的为了从PbMCs获得病原体特异性浆细胞,我们建立了TLR7/8激动剂R848体外诱导记忆b淋巴细胞分化浆细胞的方法。方法使用TLR7/8激动剂R848联合细胞因子组合,诱导接种乙肝疫苗(3年及以上)的健康志愿者来源的PbMCs,进行体外活化和分化浆细胞。分别利用ELISA和ELISPOT检测培养液上清中总IgG、HbsAg特异性IgG以及总抗体分泌细胞(ASCs)和HbsAg抗原特异性ASCs。结果成功建立R848体外诱导PbMCs中记忆b淋巴细胞分化浆细胞的方法。R848(使用质量浓度在1~2.5μg/ml)仅与IL-2联合使用,最早在第5天即可检测到特异性ASCs。结论通过该方法可以从患者恢复期少量(仅需5~10 ml)的外周血中获得抗原特异性抗体分泌细胞用于分析和分选,为中和抗体的制备提供方法。

关键词：记忆b细胞体外活化外周血单个核细胞浆细胞

类风湿关节炎患者外周血记忆b细胞池分布特征及治疗对其的影响

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中华风湿病学杂志 2017年第6期21卷 364-369页

作者：朱丽俱博苗吕晓红殷子婧蒲丹张竞樊萍武淑芳何岚西安交通大学第一附属医院风湿免疫科 710061

目的探索b细胞亚群在RA患者外周血的分布特征、与RA临床指标的相关性及治疗对其的影响,从而进一步了解b细胞在RA的发病机制中的作用.方法用流式细胞仪检测141例RA患者和33名健康对照外周血细胞表面标记CD19、CD27、免疫球蛋白（Ig）D... 详细信息

目的探索b细胞亚群在RA患者外周血的分布特征、与RA临床指标的相关性及治疗对其的影响,从而进一步了解b细胞在RA的发病机制中的作用.方法用流式细胞仪检测141例RA患者和33名健康对照外周血细胞表面标记CD19、CD27、免疫球蛋白（Ig）D,观察转换后记忆b细胞（CD19＋CD27＋IgD-）、转换前记忆b细胞（CD19＋CD27＋IgD＋）、幼稚b细胞（CD19＋CD27-IgD＋）、双阴b细胞（CD19＋CD27-IgD-）的分布,RA患者根据治疗分为TNF-α拮抗剂治疗组、传统DMARDs治疗组及初发未治疗组.了解其与临床表现、实验室检查间的关系及不同治疗对b细胞亚群分布的影响.采用SPSS 23.0分析软件,采用独立样本t检验,单因素方差分析,相关性分析用Spearman相关分析.结果 ①RA初发未治疗患者（病程〈3个月）外周血中转换前记忆b细胞的比率[（8±4）％]明显低于健康对照[（13±4）％]（t=3.3,P〈0.05）,转换后记忆b细胞比率[（18±10）％]低于健康对照[（23±7）％]（t=2.2,P〈0.05）;②RA患者转换前记忆b细胞（CD19＋CD27＋IgD＋）的比率和RA疾病活动度评分DAS28呈负相关（r=-0.23,P〈0.05）;③RA患者转换前记忆b细胞（CD19＋CD27＋IgD＋）的比率和ESR、IgG呈负相关,但与CRP、RF、抗环瓜氨酸肽抗体（ACPA）之间无明显相关性;④经过TNF-α拮抗剂治疗或传统DMARDs治疗转换后记忆b细胞及转换前记忆b细胞比率有所回升,但差异无统计学意义.结论 RA初发患者外周血中存在b细胞亚群分布异常,主要表现为转换后记忆b细胞及转换前记忆b细胞的比率降低;同时转换前记忆b细胞的比率和DAS28评分及ESR、IgG水平呈负相关;TN F-α拮抗剂及传统治疗均对RA患者外周血部分b细胞亚群的分布有一定影响,说明b细胞亚群分布改变可能在RA疾病发生发展中起重要作用.

关键词：关节炎类风湿 b细胞亚群记忆b细胞肿瘤坏死因子-α拮抗剂

抗病毒治疗对HIV-1感染者调节b细胞和记忆b细胞免疫平衡的影响

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中国艾滋病性病 2016年第3期22卷 160-164页

作者：康文臻党便利李媛李建辉汪春付白帆毛卓君姚娜谢玉梅郝春秋孙永涛第四军医大学唐都医院全军感染病诊疗中心西安710038

目的探讨抗反转录病毒治疗(ART)前后,艾滋病病毒1型(HIV-1)感染者外周血中调节b细胞(breg)和记忆b细胞(bmem)的平衡,以及白介素-10(IL-10)表达水平与HIV-1感染疾病进展的关系。方法选择30例未治疗的HIV-1感染者,于ART治疗前和治疗12周,... 详细信息

目的探讨抗反转录病毒治疗(ART)前后,艾滋病病毒1型(HIV-1)感染者外周血中调节b细胞(breg)和记忆b细胞(bmem)的平衡,以及白介素-10(IL-10)表达水平与HIV-1感染疾病进展的关系。方法选择30例未治疗的HIV-1感染者,于ART治疗前和治疗12周,分离外周血单个核细胞(PbMC),用流式细胞术(FCM)检测CD19+CD24hi CD38hi b细胞、CD19+CD24hi CD38lob细胞的及CD19+IL-10+b细胞比例的变化;用酶联免疫吸附试验法(ELISA)测定培养上清中IL-10水平,与健康对照组比较。结果相对于健康对照组,感染HIV-1后,CD19+CD24hi CD38hi b细胞的比例(P=0.0001)、breg/bmem比值(Pb细胞的比例(P=0.0005)显著降低,差异具有统计学意义。ART开展12周后,CD19+CD24hi CD38hi b细胞的比例(P=0.0069)、breg/bmem比值(P=0.0012)及上清中IL-10水平(P=0.041)均显著降低,且上清中IL-10水平与breg(R2=0.1347,P=0.0039)的比例呈正相关性,而与bmem细胞的比例呈显著负相关(R2=0.1705,P=-0.001)。结论 HIV-1感染改变了CD19+CD24hi CD38hi b细胞的比例、其相关细胞因子IL-10的表达水平,并破坏了breg/bmem平衡;经过ART治疗后,CD19+CD24hi CD38hi b细胞的比例与其相关细胞因子IL-10的表达水平及breg/bmem平衡可以得到逐渐恢复。

关键词：艾滋病病毒1型 b调节细胞记忆b细胞抗病毒治疗白细胞介素-10

不同月龄bALb/c小鼠骨髓和脾脏b细胞、脾脏记忆b细胞bCR H-CDR3组库动态变化分析

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不同月龄BALB/c小鼠骨髓和脾脏B细胞、脾脏记忆B细胞BCR H-CDR3组...

作者：马丽娜遵义医科大学

学位级别：硕士

目的:本实验以3月龄、12月龄、20月龄SPF级bALb/c小鼠为研究对象,采用高通量测序技术分析小鼠骨髓和脾脏b细胞、脾脏记忆b细胞bCR H-CDR3组库的特征,探讨不同月龄小鼠b细胞、记忆b细胞bCR H-CDR3组库的动态变化,为免疫系统衰老研究提供... 详细信息

目的:本实验以3月龄、12月龄、20月龄SPF级bALb/c小鼠为研究对象,采用高通量测序技术分析小鼠骨髓和脾脏b细胞、脾脏记忆b细胞bCR H-CDR3组库的特征,探讨不同月龄小鼠b细胞、记忆b细胞bCR H-CDR3组库的动态变化,为免疫系统衰老研究提供基础数据及新的研究思路。方法:1.分别取3、12、20月龄bALb/c小鼠骨髓和脾脏组织的b细胞、脾脏组织的记忆b细胞,样本的数量分别为:小鼠骨髓组织b细胞每个月龄5个样本、小鼠脾脏组织b细胞每个月龄5个样本、脾脏组织记忆b细胞每个月龄3个样本。2.制作组织切片分别观察3、12、20月龄小鼠脾脏组织结构的形态差异（每种月龄3只）。3.采用德国美天旎磁珠分选试剂盒分选出3、12、20月龄小鼠脾脏记忆b细胞,并用流式细胞仪鉴定分选纯度。4.采用QIAGEN基因提取试剂盒分别提取各样本中的DNA,并用分光光度计鉴定纯度。每个样本均采用多重PCR构建小鼠bCR H-CDR3组库,用琼脂糖凝胶电泳分离出所需要的目的条带（100-200bp）并割胶回收。采用高通量测序技术对bCR H-CDR3组库进行测序（测序由华大基因完成）。5.每个样本测序后获得的数据上传至IMGT（http://www,***）数据库,分析bCR H-CDR3组库序列的组成和特征。（1）采用反辛普森指数（The inverse Simpson’s diversity index,1/DS）分析CDR3组库的多样性,（2）分析bCR H-CDR3组库V、D、J基因家族的取用;（3）对AA的取用和长度分布进行分析;（4）对CDR3组库中独特AA重叠序列进行分析等。结果:1.3月龄小鼠的脾脏组织白髓多而密集,随着月龄的增加白髓结构变的不规则。2.bCR H-CDR3组库特征分析:2.1.不同月龄小鼠骨髓b细胞组库的测序及分析结果:（1）不同月龄小鼠骨髓b细胞bCR H-CDR3组库功能性的独特序列/总序列数目:M3bM1:470417/3628039;M12bM1:196523/1421157;M20bM1:242712/1487032M3bM2:518486/4184188;M12bM2:156116/1464383;M20bM2:200002/1310079M3bM3:381821/764189;M12bM3:64755/500687;M20bM3:120696/557000M3bM4:177963/1348026;M12bM4:183714/1101831;M20bM4:76015/426278M3bM5:178321/1293633;M12bM5:169852/1654244;M20bM5:67526/310777（2）不同月龄小鼠骨髓b细胞bCR H-CDR3组库均高频取用IGHV1-14、IGHV1-4、IGHV14-1、IGHV1-50、IGHV1-56、IGHV1-64家族,对高频取用家族进行统计分析发现,IGHV14-1基因家族具有统计学差异;在IGHV-IGHJ基因优势配对取用中,有IGHV14-1-IGHJ3、IGHV1-50-IGHJ4基因配对取用具有统计学差异;通过聚类分析结果显示,12月龄和20月龄的V-J基因配对取用最接近,而3月龄相差较远。（3）不同月龄小鼠骨髓b细胞bCR H-CDR3组库AA的长度均是以11-12个AA为主的高斯分布,均高频取用酪氨酸（Y）为代表的疏水性氨基酸,AA取用均无统计学差异。（4）不同月龄小鼠骨髓b细胞bCR H-CDR3组库多样性（1/DS）无统计学差异;不同月龄小鼠共同独特氨基酸数目为29742条;前10条高频克隆扩增氨基酸序列几乎都存在高度保守的氨基酸基序“WYFDV”和“YAMDY”。2.2.不同月龄小鼠脾脏b细胞的测序及分析结果:（1）不同月龄小鼠脾脏b细胞bCR H-CDR3组库功能性的独特序列/总序列数目:M3S1:778821/4490891;M12S1:101368/1038593;M20S1:134395/1290012M3S2:676115/3986587;M12S2:280350/1352262;M20S2:206742/1651382M3S3:631673/4388235;M12S3:225851/1373556;M20S3:125701/532054M3S4:601045/3909490;M12S4:265041/1536963;M20S4:172405/995363M3S5:565442/2667877;M12S5:207727/1489695;M20S5:156198/575928（2）不同月龄小鼠脾脏b细胞bCR H-CDR3组库都高频取用IGHV1-14、IGHV014-1、IGHV1-50、IGHV1-4、IGHV1-64,仅IGHV1-4基因取用具有统计学差异;在IGHD基因的取用中,IGHD3-3、IGHD6-

关键词：月龄 b细胞记忆b细胞 bCR H-CDR3组库高通量测序技术 bALb/c小鼠

基于记忆b细胞体外刺激培养的Anti-HbsAg食蟹猴单克隆抗体筛选及性质初步鉴定

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基于记忆B细胞体外刺激培养的Anti-HBsAg食蟹猴单克隆抗体筛选及...

作者：王一文厦门大学

学位级别：硕士

乙型肝炎病毒(Hepatitis b Virus,HbV)感染是全球主要的公共卫生问题之一,目前,全球约有2.4亿人为慢性乙肝感染者,每年约有60多万人死于慢性乙肝导致的肝硬化、肝癌等疾病。现有的基于干扰素和核(苷)酸类似物的治疗尚不能根治乙肝。本... 详细信息

乙型肝炎病毒(Hepatitis b Virus,HbV)感染是全球主要的公共卫生问题之一,目前,全球约有2.4亿人为慢性乙肝感染者,每年约有60多万人死于慢性乙肝导致的肝硬化、肝癌等疾病。现有的基于干扰素和核(苷)酸类似物的治疗尚不能根治乙肝。本实验室前期在Gut期刊上报道了一株针对慢乙肝的治疗性鼠源单克隆抗体E6F6及其识别的核心靶点(HbsAg-aa119-125、SA线性表位),并基于该靶点设计出乙肝治疗性表位疫苗。本研究拟从单克隆抗体水平对该疫苗介导的体液免疫反应进行初步研究。由于非人灵长类(Non-Human Primate,NHP)与人的免疫球蛋白基因高度同源,接种疫苗后可以激起相似的免疫反应,常被用作疫苗评估的动物模型,本研究选择食蟹猴作为上述疫苗评估的模型。本研究初步建立了食蟹猴记忆b细胞体外刺激培养体系并对上述表位疫苗在食蟹猴中诱导产生的抗体及其功能和识别表位进行初步探索,其结果为该治疗性疫苗的评估提供参考。研究内容共分为以下四个部分:第一,基于记忆b细胞体外刺激培养的猴源抗体筛选系统的初步建立及HbsAg特异性猴抗筛选。本研究首先在原有的人记忆b细胞体外刺激培养体系的基础上,对食蟹猴记忆b细胞分选和刺激培养条件进行了初步确定,即采用人Panb和人IgM、人IgD两种负选磁珠联用的方式进行记忆b细胞的分选;记忆b细胞按起始培养数(5-10)个/孔和104个/孔的CD40L饲养细胞共同培养至含10%FbS、50 ng/mL hIL21的RPMI 1640培养基,该体系可以有效的刺激记忆b细胞分化为浆细胞;其次我们进一步验证了文献报道抗体扩增引物的有效性。利用该系统,从28个阳性培养孔中克隆出10株HbsAg阳性抗体。第二,HbsAg阳性抗体的功能评估。评估结果显示,5株抗体1-12H4、1-23、3-13、3-23H1、3-23H4与HbsAg具有较优的抗原结合活性且能被E6F6(针对HbsAg SA线性表位的鼠抗)明显阻断,同时这些抗体在HbV转基因鼠中都显示出明显的HbsAg和HbV DNA清除效果,其中1-23和3-23H1的病毒清除能力最为显著。第三,猴源抗体的进一步人源化改造及性质鉴定。利用IMGT数据库,将1-23和3-23H1抗体轻重链可变区的骨架(Framewrok region,FR)的非人源氨基酸定点突变为人源氨基酸,并最终通过性质评估筛选性质较优的人源化抗体。进一步对这些人源化的抗体进行性质鉴定,参比亲本抗体及E6F6人源化抗体(162),最终选出人源化程度为98.33%的M1D(亲本抗体1-23)及人源化程度为97.78%的M3D(亲本抗体3-23H1),这两株抗体很好地保留了亲本抗体的抗原结合及体内抗原清除能力。对M1D、M3D广谱活性测定结果显示,M1D、M3D对乙型肝炎病毒三种主要的基因型A型、b型、C型都有较强的结合活性。第四,对人源化抗体M1D、M3D与抗原的相互作用进行研究。确定了抗体与抗原结合的关键CDR区和关键的氨基酸位点以及识别的抗原核心表位,M1D结合的核心表位为TGPCKTCT(aa1 18-125),M3D结合的核心表位为CKTCT(aa121-125)。综上,该研究对基于SA线性表位的治疗性疫苗在食蟹猴中诱导产生的抗体进行了初步探索。获得了两株食蟹猴来源的人源化抗体M1D、M3D,在HbV转基因鼠中具有显著清除HbsAg和DNA的能力。基于M1D、M3D识别表位的研究证明,二者均识别SA表位,且核心表位与E6F6识别表位部分重叠,进一步揭示SA线性表位特异性的抗体能够介导高效的HbV病毒清除,该研究结果也为基于该表位的治疗性疫苗的有效性评估提供了一定的指导意义,可为乙肝治疗性抗体药物的开发提供候选分子。此外,该研究建立的方法也可为性能优良的类人抗体开发提供新的手段。

关键词： NHP抗体记忆b细胞体外刺激培养乙肝表面抗原