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kdr突变和解毒代谢在B型烟粉虱对高效氯氰菊酯抗性中的作用

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昆虫学报 2008年第3期51卷 277-283页

作者：王利华吴益东南京农业大学植物保护学院昆虫学系农业部病虫监测与治理重点开放实验室南京210095

本研究明确了kdr突变和解毒代谢在B型烟粉虱Bemisia tabaci对高效氯氰菊酯抗性中的作用。B型烟粉虱NJ品系相对于烟粉虱敏感品系(SUD-S,非B型)对高效氯氰菊酯有266倍的抗性。对NJ品系用高效氯氰菊酯进行群体筛选获得抗性为811倍的NJ-R1品... 详细信息

本研究明确了kdr突变和解毒代谢在B型烟粉虱Bemisia tabaci对高效氯氰菊酯抗性中的作用。B型烟粉虱NJ品系相对于烟粉虱敏感品系(SUD-S,非B型)对高效氯氰菊酯有266倍的抗性。对NJ品系用高效氯氰菊酯进行群体筛选获得抗性为811倍的NJ-R1品系,对NJ品系进行单对交配筛选获得抗性达2634倍的NJ-R2品系。在NJ,NJ-R1和NJ-R2品系间,酯酶、多功能氧化酶和谷胱甘肽S-转移酶活性无显著差异,说明在筛选过程中解毒代谢没有发生变化。PASA检测结果表明,NJ-R2品系钠离子通道基因L925I突变(kdr突变)频率为100%,NJ-R1品系为80.6%,NJ品系为55%。由此可见,kdr突变频率的增加是B型烟粉虱种群对高效氯氰菊酯抗性上升的主要原因。在NJ,NJ-R1和NJ-R2品系中,增效醚(PBO)对高效氯氰菊酯的增效作用均为20倍左右,而PBO对SUD-S品系没有任何增效作用。PBO能同时抑制烟粉虱的多功能氧化酶和酯酶,通过与TPP增效作用进行对比表明,在B型烟粉虱中PBO所产生的增效作用主要来源于对酯酶的抑制。因此,B型烟粉虱品系(NJ-R2,NJ-R1和NJ)与非B型SUD-S品系相比存在20倍左右的先天抗性,该先天抗性主要与B型烟粉虱的特有酯酶有关。在B型烟粉虱品系对高效氯氰菊酯的抗性中,抗性水平完全由kdr突变频率高低所决定。

关键词： B型烟粉虱高效氯氰菊酯抗药性解毒代谢 kdr突变

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昆虫共生菌与宿主的解毒代谢关系研究进展

农药学学报 2019年第5期21卷 729-735页

作者：张云骅李建洪万虎华中农业大学植物科学技术学院昆虫资源利用与害虫可持续治理湖北省重点实验室

昆虫共生菌参与宿主的各种生理活动,已被作为昆虫的“多功能器官”靶向进行研究,近期研究表明昆虫共生菌与宿主的解毒代谢功能相关。本文聚焦昆虫共生菌对宿主解毒代谢的积极补偿作用,综述了昆虫共生菌在昆虫营养代谢和解毒代谢中的功能... 详细信息

昆虫共生菌参与宿主的各种生理活动,已被作为昆虫的“多功能器官”靶向进行研究,近期研究表明昆虫共生菌与宿主的解毒代谢功能相关。本文聚焦昆虫共生菌对宿主解毒代谢的积极补偿作用,综述了昆虫共生菌在昆虫营养代谢和解毒代谢中的功能,昆虫共生菌直接对有毒物质进行代谢或间接介导宿主的解毒酶或相关基因的表达,进而影响昆虫的解毒代谢功能,提升昆虫宿主在逆境压力与农药胁迫中的适应力与竞争力。对今后关于共生菌与宿主解毒代谢研究的方向进行了展望。

关键词：昆虫共生菌宿主解毒代谢解毒酶间接调控研究进展

果蝇黄素单加氧酶对杀虫剂的解毒代谢以及芥子碱等对糖脂代谢的影响

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果蝇黄素单加氧酶对杀虫剂的解毒代谢以及芥子碱等对糖脂代谢的影...

作者：薛圆南京农业大学

学位级别：硕士

黄素单加氧酶(flavin-containing monooxygenase,FMO)普遍存在于哺乳动物组织的内质网中,参与对含硫、氮、磷、硒等亲核外源物的氧化代谢,被认为是一类重要的解毒代谢酶。目前有关哺乳动物FMO参与药物解毒代谢(包括农药)的研究已有较多... 详细信息

黄素单加氧酶(flavin-containing monooxygenase,FMO)普遍存在于哺乳动物组织的内质网中,参与对含硫、氮、磷、硒等亲核外源物的氧化代谢,被认为是一类重要的解毒代谢酶。目前有关哺乳动物FMO参与药物解毒代谢(包括农药)的研究已有较多报道,但除解毒代谢外,FMO是否还有其他生理目前仍是未解之谜。昆虫FMO是否同样具有对杀虫剂的解毒代谢能力也未见研究报道。本研究将在前期本实验室发现抗性甜菜夜蛾具有较高FMO表达水平的基础之上,通过采用UAS/GAL4二元表达系统构建过表达或下调表达FMO基因的转基因果蝇系,测定FMO表达上调或下调转基因果蝇系对杀虫剂敏感性的变化来探讨FMO对杀虫剂的解毒代谢能力,同时研究FMO对糖脂代谢的影响,为进一步明晰FMO的功能进行了 FMO蛋白的体外表达。另一方面,探讨了芥子碱和L-肉毒碱等季铵类化合物对果蝇虫体及胚胎细胞(S2)糖脂水平的影响,研究结果对揭示FMO的生理、毒理功能具有重要意义。一、FMO基因沉默或过表达影响黑腹果蝇对杀虫剂的敏感性利用UAS/GAL4二元表达系统构建了 FMO基因过表达与基因沉默型果蝇品系,采用饲料感染法测定了FMO1和FMO2基因过表达型、基因沉默型果蝇以及野生型果蝇对9种类型的15种不同杀虫剂的敏感性。结果表明,FMO1与FMO2下调表达与上调表达显著影响果蝇对硫双威、茚虫威、氰氟虫腙的敏感性水平,FMO1与FMO2表达水平变化对吡虫啉、三氟氯氰菊酯、甲胺磷、毒死蜱这4种杀虫剂敏感性的影响并不完全一致,2个FMO表达水平的变化对甲基嘧啶磷、乐果、溴虫腈、三唑磷、氯虫苯甲酰胺、杀虫单、灭多威、噻虫啉的毒力则没有显著影响。这些结果表明,硫双威、茚虫威、氰氟虫腙这3种杀虫剂既能被FMO1也能被FMO2所代谢而解毒,而吡虫啉、三氟氯氰菊酯、甲胺磷、毒死蜱则只能被其中一种FMO代谢解毒,甲基嘧啶磷、乐果、溴虫腈、三唑磷、氯虫苯甲酰胺、杀虫单、灭多威、噻虫啉则不能被FMO代谢解毒。二、芥子碱、L-肉毒碱等对果蝇糖脂水平的影响文献报道FMO与心血管疾病有关系,影响糖脂代谢水平,但其机理并不清楚,本实验室魏琪博士通过代谢组学分析发现,果蝇体内FMO表达水平的升高或下调显著影响体内芥子碱的水平,暗示FMO可能代谢芥子碱这类具有季铵碱的化合物,所以本研究探讨芥子碱及其结构类似物肉毒碱、三甲胺等化合物对果蝇糖脂水平的影响,以了解FMO对糖脂代谢的调控作用。L-肉毒碱和芥子碱处理S2细胞后,细胞体内甘油三酯、游离脂肪酸、总胆固醇和葡萄糖水平显著降低,其中芥子碱还使细胞内糖原水平下降;胆碱处理细胞后,细胞体内甘油三酯、游离脂肪酸水平显著降低;TMA处理细胞后,细胞体内甘油三酯、游离脂肪酸和葡萄糖水平显著降低;TMAO处理细胞后、细胞体内甘油三酯水平显著降低。本研究中的处理化合物对细胞内海藻糖含量均无显著影响。当给果蝇饲料中添加L-肉毒碱后,虫体内甘油三酯、游离脂肪酸、总胆固醇和葡萄糖水平显著降低;添加饲喂TMA后,虫体内葡萄糖、糖原和海藻糖水平显著降低;添加饲喂TMAO后,虫体内海藻糖水平显著降低。胆碱对以上各指标均无影响。综上所述,芥子碱和肉毒碱能够显著影响果蝇体内糖脂水平。三、黑腹果蝇FMO的体外表达利用原核表达系统及Bac-to-Bac杆状病毒表达系统开展了 DmFMO的体外表达研究。原核表达研究中,将FMO基因重组到pET32a和pET30a载体上,蛋白均以包涵体的形式存在,优化表达条件,仍不能解决蛋白不可溶问题,换用pColdTM-TF载体后可以获得可溶蛋白,但应用TNB/DTNB法未测出酶活性,原核外源表达酶不具有活性。换用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统后,表达得到的重组蛋白同样存在溶解问题。综上所述,DmFMO蛋白虽然可以成功进行体外表达,但存在蛋白可溶性低及蛋白不具有活性的难题。

关键词：黄素单加氧酶杀虫剂解毒代谢糖脂代谢蛋白表达黑腹果蝇

PxGSTO4介导小菜蛾对茚虫威解毒代谢机制研究

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PxGSTO4介导小菜蛾对茚虫威解毒代谢机制研究

作者：王茹梦华中农业大学

学位级别：硕士

小菜蛾Plutella xylostella(L.)是世界范围内危害十字花科蔬菜的重要害虫之一,同时其抗性的发展也日趋严重。茚虫威是一种对鳞翅目害虫包括小菜蛾作用显著、以钠离子通道为作用靶标的噁二嗪类杀虫剂。1998年上市推广以来,由于其不科学... 详细信息

小菜蛾Plutella xylostella(L.)是世界范围内危害十字花科蔬菜的重要害虫之一,同时其抗性的发展也日趋严重。茚虫威是一种对鳞翅目害虫包括小菜蛾作用显著、以钠离子通道为作用靶标的噁二嗪类杀虫剂。1998年上市推广以来,由于其不科学合理使用,小菜蛾田间种群已对茚虫威产生高水平抗性。前期研究发现靶标位点钠离子通道的突变与小菜蛾对茚虫威抗性相关,但解毒酶是否参与介导代谢抗性未知。因此,本研究监测了2017-2018年湖北四个地区小菜蛾田间种群对茚虫威的抗药性并检测其解毒酶活性,通过软件分析了茚虫威与其他药剂对小菜蛾毒力和茚虫威与解毒酶之间的相关性。基于此,进一步分析小菜蛾田间抗性种群对茚虫威解毒代谢机制以及对其转录调控进行了初步研究,主要结果如下:1.监测了湖北武穴、新州、当阳、云梦四个地区2017-2018年小菜蛾田间种群对茚虫威的抗性水平,结果表明小菜蛾田间种群已对茚虫威产生不同程度的抗性(Resistance Ratio=0.3-17.7),新洲地区2017年5月和当阳地区2018年10月采集的小菜蛾达到中等水平抗性。云梦和当阳地区小菜蛾对茚虫威的抗性水平呈升高趋势,而新洲和武穴地区呈降低趋势。通过软件分析茚虫威与其他药剂对小菜蛾田间种群毒力相关性可知,茚虫威与氯虫苯甲酰胺、甲维盐、乙基多杀菌素和氰氟虫腙之间不存在交互抗性。通过解毒酶活力测定及相关性分析表明,与敏感种群相比,三种解毒酶活力差异较大,且谷胱甘肽S-转移酶(r=0.975,P=0.025)与茚虫威对小菜蛾田间种群毒力存在显著性相关,而羧酸酯酶(r=0.535,P=0.456)和细胞色素P450多功能氧化酶(r=0.082,P=0.918)与茚虫威对小菜蛾田间种群的毒力不存在显著性相关。因此,推测GSTs在小菜蛾对茚虫威敏感性降低的过程中起到重要作用。2.通过测定敏感种群WH-SS和茚虫威田间抗性种群GD-RR小菜蛾的CarE、GSTs和P450酶活力,结果显示:在G5代时,田间抗性种群的三种解毒酶的比活力都显著高于敏感种群,分别上升1.83倍、3.98倍和1.71倍,且在田间抗性种群GD-RR药剂筛选的过程中,GSTs酶活力显著上升;进一步通过增效剂试验发现,磷酸三苯酯(TPP,Triphenyl phosphate)、胡椒基丁醚(PBO,Piperomyl butoxide)和顺丁烯二酸二乙酯(DEM,Diethyl Maleate)对小菜蛾茚虫威田间抗性种群的增效比分别为1.53、2.50和3.32,综上结果表明GSTs在代谢茚虫威的过程中可能发挥主要作用。3.通过检测与解毒代谢相关的22个GSTs基因mRNA的表达量,发现与敏感种群相比,PxGSTO4在田间抗性种群GD-RR中上调倍数5.7,通过RNAi技术沉默PxGSTO4后,小菜蛾GSTs酶活力显著性下降,对茚虫威的敏感性显著性上升。表明在小菜蛾中PxGSTO4的过表达与茚虫威的解毒代谢相关。4.根据已报道的文献,选取小菜蛾体内与解毒代谢相关的转录因子13条,通过实时荧光定量PCR检测表达量,发现其中PxCRBL2表达量上调倍数12.4,利用RNAi技术沉默小菜蛾PxCRBL2后发现,小菜蛾对茚虫威的敏感性发生显著性上升且GSTs酶活力显著降低,通过检测沉默后GSTs表达量的变化,发现其中PxGSTO4基因表达显著下调。表明转录因子PxCRBL2可能通过调控PxGSTO4的表达从而介导小菜蛾对茚虫威的解毒代谢。

关键词：小菜蛾茚虫威抗药性解毒代谢 GSTs 转录因子

ABC转运蛋白在二化螟对氯虫苯甲酰胺和阿维菌素解毒代谢中的作用研究

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ABC转运蛋白在二化螟对氯虫苯甲酰胺和阿维菌素解毒代谢中的作用...

作者：杨雪梅扬州大学

学位级别：硕士

二化螟（Chilo suppressalis）是水稻作物上最主要的害虫之一。由于化学农药的不合理使用,导致二化螟对杀虫剂的抗药性迅速发展,进一步加大了防治难度。ABC转运蛋白（ATP-binding cassette transporter）是生物中最大的跨膜蛋白家族之一... 详细信息

二化螟（Chilo suppressalis）是水稻作物上最主要的害虫之一。由于化学农药的不合理使用,导致二化螟对杀虫剂的抗药性迅速发展,进一步加大了防治难度。ABC转运蛋白（ATP-binding cassette transporter）是生物中最大的跨膜蛋白家族之一,广泛存在于古生菌、真细菌及真核生物中,能够对细胞中多种物质如脂类、氨基酸、多肽类、代谢产物、金属离子、毒素和化学治疗药物等进行跨膜转运。ABC转运蛋白参与对药物的吸收与排泄,而不经过其他酶的修饰,因此在药物代谢动力学机制上起重要作用。本研究利用RNA-Seq技术,对LC30亚致死剂量氯虫苯甲酰胺处理的二化螟幼虫进行比较转录组分析,探索氯虫苯甲酰胺对二化螟幼虫基因表达的影响。研究结果共鉴定出908个差异表达基因（DEGs）,其中441个基因表达上调,467个个基因表达下调。基因富集分析表明,下调的DEGs主要与糖类、能量、脂肪和氨基酸代谢及翻译后修饰有关,参与信号转导的大部分DEGs则上调表达。通过数据库检索,进一步将差异表达基因（DEGs）分类并富集在不同的功能类别和通路中,利用RT-qPCR对参与防御和解毒代谢的DEGs的表达变化进行验证。研究结果为理解二化螟的解毒代谢分子机制奠定基础。从二化螟基因组和转录组中共鉴定到54个ABC转运蛋白,通过Blast比对与系统发育分析,将ABC转运蛋白分为八个亚家族（ABCA-ABCH）,包括6个ABCA亚家族基因,10个ABCB亚家族基因,12个ABCC亚家族基因,2个ABCD亚家族基因,1个ABCE亚家族基因,3个ABCF亚家族基因,16个ABCG亚家族基因和4个ABCH亚家族基因。ABC转运蛋白基因序列的开放阅读框大小范围为1674bp（CsABCA13）到9273 bp（CsABCB1B）之间,编码558～3091个氨基酸,分子量大小在 60.96 kDa（CsABCA13）到341.55 kDa（CsABCB1B）之间,等电点介于5.55～9.26之间。系统发育分析表明,二化螟CsABCH与CsABCA和CsABCG家族的同源性最近,CsABCC与CsABCE和CsABCD具有较高的同源性,CsABCB与CsABCC具有很高的同源性。相同亚家族的基因聚为一支,且每个亚家族都有明显的功能聚类。杀虫剂增效作用实验表明,使用ABC转运蛋白抑制剂维拉帕米处理后可显著增加氯虫苯甲酰胺和阿维菌素对二化螟的毒力作用。结合转录组分析结果,对氯虫苯甲酰胺处理24小时后引起表达量变化的21个ABC基因进行验证,其中6个ABC转运蛋白基因显著上调,包括CsABCC8、CsABCG1C和CsABCH1等。经阿维菌素处理24小时后有6个ABC转运蛋白基因显著上调,包括CsABCA4、CsABCE1、CsABCF1、CsABCF2、CsABCC8和CsABCH1。同时测定了氯虫苯甲酰胺和阿维菌素处理后,ABC转运蛋白基因在解毒相关组织中的表达变化。利用RT-qPCR检测CsABCC8,CsACG1C和CsABCH1在二化螟不同发育阶段和不同组织的表达量,CsABCC8表达量明显高于CsABCG1C和CsABCH1在不同龄期的表达量,CsABCG1C和CsABCH1在幼虫阶段的表达量均较低。组织表达分析结果显示,CsABCC8基因在二化螟不同组织中的表达量均较高,在脑中的表达量最高。CsABCG1C和CsABCH1基因在二化螟神经索、脑和卵巢中均有较高表达,且CsABCG1C基因在二化螟表皮中也有较高的表达。为进一步验证二化螟ABC转运蛋白对杀虫剂的转运功能,我们对前期发现过表达的CsABCC8,CsABCG1C和CsABCH1等5个ABC基因的开放阅读框进行克隆并体外表达。通过构建稳定表达的pFastBACHTA真核表达体系,将二化螟CsABC和对照绿色荧光蛋白EGFP在昆虫Sf9细胞中重组表达。利用免疫荧光技术,检测到重组蛋白在细胞中成功表达。使用CCK8方法对表达不同重组蛋白的细胞毒性进行测定,在不使用杀虫剂处理下,表达CsABCC8、CsABCH1和CsABCE1的细胞活性显著高于表达EGFP的细胞活性。在使用杀虫剂处理下,相比于表达EGFP的细胞活性,表达CsABCC8、CsABCH1和CsABCE1蛋白的细胞活性进一步显著增加,表达的ABC蛋白增加了细胞对杀虫剂的外排作用从而显著降低杀虫剂对Sf9细胞的毒性。其中,相比于表达EGFP的细胞,表达CsABCC8和CsABCH1的细胞对氯虫本甲酰胺、溴氰虫酰胺、阿维菌素、氟虫腈和毒死蜱的细胞活性显著增加,表达CsABCE1的细胞对氯虫本甲酰胺、溴氰虫酰胺、阿维菌素、溴氰菊酯和茚虫威的细胞活性显著增加,说明二化螟CsABCC8、CsABCH1和CsABCCE1参与了对杀虫剂的转运代谢。本文研究结果为二化螟ABC蛋白转运代谢杀虫剂提供直接证据,进一步丰富了昆虫对杀虫剂的抗药性机制

关键词：二化螟 ABC转运蛋白转录组基因表达解毒代谢

棉铃虫Clan 2和线粒体Clan中细胞色素P450基因的解毒代谢功能研究

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棉铃虫Clan 2和线粒体Clan中细胞色素P450基因的解毒代谢功能研究

作者：屈琼南京农业大学

学位级别：硕士

细胞色素P450是一类在生物体内广泛分布的氧化酶。P450通过催化单个氧原子插入底物,增加底物的亲水性从而促进下游的水解、结合、糖基化等反应。在昆虫体内,P450作为重要的解毒酶系,参与昆虫对植物次生物质和杀虫剂的化学防御过程,对昆... 详细信息

细胞色素P450是一类在生物体内广泛分布的氧化酶。P450通过催化单个氧原子插入底物,增加底物的亲水性从而促进下游的水解、结合、糖基化等反应。在昆虫体内,P450作为重要的解毒酶系,参与昆虫对植物次生物质和杀虫剂的化学防御过程,对昆虫寄主选择以及杀虫剂抗性的演化具有重要的贡献。昆虫P450主要分为4个集团(clan),但一直以来,功能研究主要集中在广泛扩增且被认为与化学防御相关的Clan 3和Clan 4中,而进化保守的Clan 2和线粒体Clan(Clan M)中的P450功能研究较少,一般认为其与昆虫的生理过程相关,主要参与昆虫的内源性激素、信号化合物的合成或代谢。然而,之前少量的研究也发现Clan 2和Clan M中P450基因的转录水平可以被多个外源化合物诱导上调,且Clan M中个别P450可以代谢杀虫剂,预示这两个集团中的P450具有潜在的外源化合物解毒能力。本研究针对典型的多食性害虫-棉铃虫体内的全部8个Clan 2和10个Clan M P450基因,通过基因克隆、体外功能验证以及外源化合物诱导三个方面,筛选了两个集团中P450在植物次生物质和杀虫剂解毒中的作用和潜力,研究结果为棉铃虫化学防御、害虫抗药性分子机理的研究提供了重要信息和新的视角。具体结果如下:1.棉铃虫Clan 2和Clan M细胞色素P450基因的体外表达及体外代谢体系构建基因组数据显示,棉铃虫体内有8个Clan 2和10个Clan M P450且其中多个成员的转录水平可以被外源化合物诱导上调或在杀虫剂抗性品系体内组成型上调,具有解毒代谢外源化合物的潜力。为了证实其功能,本研究对这18个P450基因进行了克隆,之后利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统(Bac-to-Bac)在Sf9细胞中对克隆的P450进行了体外表达,其中Clan 2 P450与棉铃虫细胞色素P450还原酶(CPR)进行共表达,Clan M P450与棉铃虫铁氧还蛋白(Adx)以及铁氧还蛋白还原酶(Ad R)进行共表达。还原型CO差光谱检测结果显示,除了Clan M中的CYP49A1和CYP428A1之外,其余16个P450均成功在体外进行了表达。模式底物代谢检测结果显示,体外重组的Clan 2和Clan M P450中均有成员表现出氧脱烷基或苄基的能力,说明线粒体和微粒体P450电子传递体系在体外均可正常运行。本研究在体外成规模表达了棉铃虫所有Clan 2和Clan M P450,并成功构建线粒体P450体外电子传递体系,为棉铃虫两个集团P450对外源化合物的体外代谢功能验证奠定了重要基础。2.棉铃虫Clan 2和Clan M细胞色素P450对外源化合物的体外代谢之前的研究发现,以氰戊菊酯为代表的杀虫剂和2-十三烷酮为代表的植物次生性化合物可以诱导棉铃虫Clan 2和Clan M中多个P450基因表达量的上调,但目前还没有证据证明两个集团的P450直接参与这些化合物的解毒代谢。所以本研究利用重组P450,在体外检测了对艾氏剂、顺式氰戊菊酯、2-十三烷酮和花椒毒素的代谢能力。体外代谢结果显示,棉铃虫Clan 2中的CYP305B1和CYP18A1以及线粒体P450CYP333B3具有环氧化艾氏剂的能力,Clan2中的CYP305B1和CYP339A1能代谢顺式氰戊菊酯,Clan M中的CYP303A1可以高效代谢2-十三烷酮,所有P450均不能代谢花椒毒素。此外还发现,线粒体P450与Adx/Ad R的共表达比例会影响重组P450的表达量和代谢活性,MOI比例为1:1:1时,P450蛋白表达量和代谢活性达到较合适的平衡。本研究为昆虫化学防御以及昆虫-寄主共同进化的分子机制研究提供重要线索,同时为杀虫剂抗性机理的研究提供了更多的潜在抗性基因。3.棉铃虫Clan 2和Clan M细胞色素P450基因的表达模式细胞色素P450在昆虫体内的时间/空间表达模式以及对外源化合物的响应通常与其功能有关。为了进一步了解棉铃虫Clan 2和Clan M中P450在生长发育和解毒代谢中发挥的作用,本研究通过转录组数据分析发现棉铃虫CYP333B3、CYP333A1和CYP18A1从卵到蛹的4个生长发育期和中肠、脂肪体、表皮等14个组织均有较高水平的表达。CYP303A1和CYP49A1在蛹期高表达,CYP307A2特异性在气管中高表达。此外,转录组结果显示,在花椒毒素诱导下,Clan 2中的CYP18B1被诱导上调2.1倍。定量PCR检测发现在顺式氰戊菊酯诱导下,Clan M中的CYP301A1,Clan 2中的CYP307A2、CYP15C1和CYP18A1被诱导上调,上调倍数为1.8倍左右。总体来说,两个集团的P450基因转录水平对两种外源化合物的响应程度有限。上述研究结果为Clan 2和Clan M P450功能的预测提供了重要信息。同时,外源化合物诱导和功能表达研究也表明了棉铃虫Clan 2

关键词：棉铃虫 Clan 2 P450 线粒体P450 解毒代谢外源化合物表达模式

小菜蛾解毒代谢相关miRNA鉴定及表达分析

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小菜蛾解毒代谢相关miRNA鉴定及表达分析

作者：黄献彬福建农林大学

学位级别：硕士

小菜蛾Plutella xylostella (L.)是世界性迁飞害虫,主要危害十字花科蔬菜,寄主已多达40多种,且适应性很强,已经对几乎所有生产上使用的化学农药和生物农药Bt产生了显著抗性。MicroRNA (miRNA)是一类内源性的长度约为19-23 nt的单链非编... 详细信息

小菜蛾Plutella xylostella (L.)是世界性迁飞害虫,主要危害十字花科蔬菜,寄主已多达40多种,且适应性很强,已经对几乎所有生产上使用的化学农药和生物农药Bt产生了显著抗性。MicroRNA (miRNA)是一类内源性的长度约为19-23 nt的单链非编码小分子RNA,通过碱基互补配对原则与相应的靶基因的mRNA (messenger RNA, mRNA)结合,进而调控靶基因的表达。研究表明,昆虫体内的解毒代谢蛋白家族主要包括细胞色素单加氧酶(cytochrome P450 monooxygenases, P450)、羧酸酯酶(Carboxylesterases, CarEs)、谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione S-transferases, GSTs)以及ABC转运蛋白(ATP-binding cassette transporters, ABC transporters)。目前对于参与解毒代谢的miRNA尚不清楚。本研究基于敏感品系和抗性品系小菜蛾转录组数据,筛选、鉴定出小菜蛾体内与解毒代谢相关的多个miRNA,初步探讨了这些miRNA与小菜蛾解毒代谢的关系。主要研究结果如下：1.通过对不同品系中具有高差异表达的miRNA进行筛选,得到了17个显著差异表达的miRNA。进而对这些差异显著的miRNA进行家族分析,发现这些家族的基因保守性高,且进化的距离与其物种的亲缘关系有关。2.通过对筛选出的miRNA进行靶基因预测,得到了1,072个靶基因。进一步对差异miRNA的靶基因进行筛选,靶定到参与解毒代谢的4个基因家族、6个miRNA及48个靶基因。把48个靶基因与6个miRNA进行数字表达量及结合位点分析,筛选得到了5个miRNA及9个靶基因。3.把筛选后的niRNA及其靶基因进行实时荧光定量PCR检测,其中5个miRNA的表达趋势与数字表达谱一致,9个靶基因在毒死蜱抗性品系均为上调表达,而在氟虫腈抗性品系有1个基因的表达为下调,其余8个基因为上调。本研究筛选得到小菜蛾高差异表达的miRNA,并对这些miRNA进行了分析及靶基因预测,获得与解毒代谢相关miRNA及靶基因。荧光定量PCR分析了这些niRNA及靶基因在敏感品系和抗性品系中的表达变化。研究结果可为进一步探究miRNA调控解毒代谢基因的机制提供理论基础,为昆虫抗药性的研究及防治提供新思路。

关键词：小菜蛾 miRNA 解毒代谢荧光定量PCR

刺参（Apostichopus japonicus）在氨氮胁迫下解毒代谢途径与生理健康评价技术的研究

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刺参（Apostichopus japonicus）在氨氮胁迫下解毒代谢途径与生理...

作者：王国辉中国海洋大学

学位级别：硕士

氨氮是养殖水环境中重要的污染胁迫因子。本文通过研究刺参在氨氮胁迫下解毒代谢相关基因的表达分析、酶活性和含氮化合物含量变化，以及免疫和抗氧化指标的变化情况，初步探讨了刺参在氨氮胁迫下的解毒代谢机制和生理健康水平，主要包... 详细信息

氨氮是养殖水环境中重要的污染胁迫因子。本文通过研究刺参在氨氮胁迫下解毒代谢相关基因的表达分析、酶活性和含氮化合物含量变化，以及免疫和抗氧化指标的变化情况，初步探讨了刺参在氨氮胁迫下的解毒代谢机制和生理健康水平，主要包括三方面内容：(1)刺参谷氨酸脱氢酶(GDH)、谷氨酰胺合成酶(GS)基因片段的克隆和序列分析;(2)刺参在氨氮胁迫下体内氨转运和代谢途径的研究;(3)氨氮胁迫对刺参免疫和抗氧化指标的影响。主要结果如下：1刺参氨氮解毒代谢相关基因片段的克隆和序列分析本文以刺参呼吸树为模板，利用COEDHOP网站和Primer Premier5.0设计简并引物，通过RT-PCR扩增技术，克隆了刺参GDH基因和GS基因的部分序列。其中，GDH基因片段长693bp，编码231个氨基酸，通过氨基酸同源性分析发现其与点蜂缘蝽(Riptortus pedestris)的相似性最高，为78%，GeneBank注册号为KJ839834;GS基因片段长636bp，编码212个氨基酸，其与普通海胆(Paracentrotus lividus)的相似性最高，为78%，GeneBank注册号为KJ839835。2刺参在氨氮胁迫下体内氨转运和代谢途径的研究本实验梯度设置为：对照组（自然海水--0.01mg/L）、0.5mg/L、1.25mg/L处理组，取样时间为0、2、6、12、24和48h，分别取刺参的体腔液、呼吸树和体壁等组织，测定谷氨酸脱氢酶（GDH）、谷氨酰胺合成酶（GS）活力、谷氨酰胺（Gln）含量和黄嘌呤氧化还原酶（XOR）活力、尿酸（UA）含量、精氨酸酶（Arg）活力、尿素（Urea）含量以及关键基因表达水平等指标。结果表明：氨氮胁迫对刺参体腔液氨氮含量和呼吸树、体壁和体腔液的GDH、GS活力、Gln含量、XOR活力、Arg活力、Urea含量以及呼吸树GDH、GS、XOR、Arg基因表达影响显著(P解毒代谢途径，可以通过将氨氮转化为Gln和Urea来降低氨氮对机体的毒害作用。3氨氮胁迫对刺参免疫和抗氧化指标的影响实验设0、0.5和1.25mg/L氨氮处理组，0、2、6、12、24、48h取样，测定了刺参体腔液总体腔细胞数、凝集活性、溶菌活性、抗菌活性，以及体腔液和体壁的总抗氧化能力（T-AOC），超氧化物歧化酶（SOD）活力，还原型谷胱甘肽（GSH）含量以及还原性谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽（GSH/GSSG）。结果表明，氨氮胁迫对刺参体腔液总体腔细胞数量、凝集活性、溶菌活性、抗菌活性，以及体腔液和体壁的T-AOC能力，SOD活力，GSH含量以及GSH/GSSG等指标影响显著。各处理组中，总体腔细胞数量在12h内显著降低，之后逐渐上升并恢复至对照组水平;溶菌活力则在6h内逐渐升高，之后迅速下降至对照组水平;溶菌活力和凝集活力则呈不同程度的下降趋势。体腔液T-AOC能力、SOD活性、GSH含量随胁迫时间的延长其活性显著下降，于12h后保持稳定并显著低于对照组水平;体壁T-AOC，SOD活性则在6h内迅速上升并显著高于对照组水平，之后逐渐下降，至48h时显著低于对照组水平;GSH含量以及GSH/GSSG在6h时上升至最大值，之后逐渐恢复至对照组水平。由此说明，氨氮胁迫对刺参免疫和抗氧化系统产生影响，并且长时间的氨氮胁迫可以导致刺参免疫水平和抗氧化水平降低。

关键词：氨氮刺参解毒代谢生理健康

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共生菌介导褐飞虱解毒代谢机制研究

共生菌介导褐飞虱解毒代谢机制研究

作者：唐涛华中农业大学

学位级别：硕士

昆虫共生菌协助宿主包括营养代谢、生物合成等各种生理活动。目前已有报道昆虫共生菌参与宿主对外源有毒物质解毒代谢。褐飞虱是水稻上主要害虫之一,其食性单一,化学防治是目前控制其种群的主要措施,且田间种群已对绝大多数化学杀虫剂... 详细信息

昆虫共生菌协助宿主包括营养代谢、生物合成等各种生理活动。目前已有报道昆虫共生菌参与宿主对外源有毒物质解毒代谢。褐飞虱是水稻上主要害虫之一,其食性单一,化学防治是目前控制其种群的主要措施,且田间种群已对绝大多数化学杀虫剂进化了不同程度的抗药性。目前已有研究表明昆虫共生菌协同宿主解毒代谢及介导宿主抗药性。基于此,本研究探索了褐飞虱田间种群共生菌介导宿主解毒代谢的作用机制。主要研究结果如下:1.通过饲喂四环素和环丙沙星介导清除褐飞虱共生菌,结合实时荧光定量PCR检测褐飞虱共生菌载量,结果表明四环素和环丙沙星均可有效清除褐飞虱共生菌。明确了四环素和环丙沙星最佳处理浓度和处理时间分别为200 mg/L和24 h。将抗生素处理后的褐飞虱接回水稻苗,实时荧光定量PCR检测发现接回24小时后共生菌载量恢复到正常水平。2.采用药膜法测定了四环素和环丙沙星处理的褐飞虱南昌、无锡、孝感种群的药剂敏感性,结果表明抗生素处理褐飞虱种群对吡虫啉、毒死蜱、噻虫胺等杀虫剂敏感性显著上升。进一步检测了抗生素处理褐飞虱种群解毒酶活力变化,结果发现四环素处理褐飞虱种群谷胱甘肽S-转移酶和细胞色素P450活力分别显著下降了19%和32%,环丙沙星处理后褐飞虱谷胱甘肽S-转移酶和细胞色素P450活力分别显著下降了10%和39%;而酯酶无显著变化。探究了抗生素处理对褐飞虱谷胱甘肽S-转移酶和细胞色素P450基因表达的影响,实时荧光定量PCR检测发现抗生素处理褐飞虱种群谷胱甘肽S-转移酶基因Nl GSTd2、Nl GSTs1和Nl GSTe1和细胞色素P450基因CYP4DD1、CYP425A1、CYP306A2、CYP303A1与CYP3115A1的表达显著下调。表明四环素和环丙沙星处理褐飞虱种群对杀虫剂敏感性上升与谷胱甘肽S-转移酶和细胞色素P450基因下调表达相关。3.利用扩增子测序分析了南昌、无锡、孝感三个种群褐飞虱共生菌多态性,结果表明三个种群共生菌组成成分无显著差异,但各组分比例差异明显。其中,Wolbachia、Arsenophonus、Acinetobacter、Lactobacillus、Klebsiella等为三个种群的优势菌属。基于药剂敏感性测定结果,推测Wolbachia、Arsenophonus、Acinetobacter、Lactobacillus、Klebsiella可能参与介导褐飞虱解毒代谢。此外,四环素和环丙沙星处理后褐飞虱共生菌组成成分不变,各组分比例差异显著。绝对定量结果表明四环素和环丙沙星处理后共生菌Arsenophonus和Acinetobacter拷贝数均显著下降,表明Arsenophonus和Acinetobacter在介导褐飞虱解毒代谢中发挥关键作用。PICRUST预测宏基因组功能显示褐飞虱共生菌未直接参与杀虫剂降解代谢,且抗生素处理后预测共生菌功能未发生明显变化,这从侧面印证了褐飞虱共生菌通过调控宿主解毒酶基因表达间接介导褐飞虱解毒代谢。

关键词：褐飞虱共生菌解毒代谢扩增子测序 P450 GST