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补体c3d分子的杆状病毒表达和分子进化研究

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补体C3d分子的杆状病毒表达和分子进化研究

作者：孙盈天津大学

学位级别：硕士

补体c3d分子（complement component3d）是补体c3活化后的一个裂解片段，能够与受体cR2结合，是连接固有免疫与获得性免疫的一种重要免疫分子。目前对c3d的研究主要停留在分子佐剂阶段，将c3d三连体与抗原基因形成融合蛋白从而成千倍的... 详细信息

补体c3d分子（complement component3d）是补体c3活化后的一个裂解片段，能够与受体cR2结合，是连接固有免疫与获得性免疫的一种重要免疫分子。目前对c3d的研究主要停留在分子佐剂阶段，将c3d三连体与抗原基因形成融合蛋白从而成千倍的提高机体特异性免疫应答反应，但对不同物种c3d分子变异、结构与功能关系鲜见报道。本研究通过克隆了16种不同禽类c3d基因，表达获得了鸡c3d重组蛋白并分析了c3d分子进化与结构、功能的关系，以丰富c3d的理论与应用研究。首先，克隆了16种不同禽类的c3d基因，登录Genbank并将之与哺乳动物c3d基因序列比较，进行生物信息学分析，构建基于c3d编码氨基酸序列的系统进化树，结果显示哺乳动物与禽类分别居进化树两端，相距较远，与传统物种关系差异吻合;在禽类区块内部分化为两个部分，但与禽类所属目、科无关。对c3d分子进化过程的选择情况进行分析，表明其整个基因处于纯化选择，但有8个可能发生阳性选择的氨基酸位点。以已发表的人c3d三级结构为模板，同源模建获得16种禽类c3d的三级结构，以鸡c3d结构为模板，标记阳性选择位点位置，显示其均处于暴露区，可能对于支持抗原结合域、提供cR2结合所需能量等有重要作用。其次，成功构建鸡c3d的bac-to-bac杆状病毒表达系统，获得pFB-c3d-BAc重组病毒，在sf9昆虫细胞内检测到高效表达的c3d蛋白;应用Anti-his单抗和Anti-c3d多抗进行Western-blot和免疫荧光检测，表明重组蛋白大小约为35kd，主要为细胞内表达，具有良好的免疫原性，为其免疫机制的研究奠定了基础。最后，采用基于寡核苷酸探针的基因芯片方法检测了16种禽类对于禽白血病病毒（ALV）B、E、J三种亚型的感染情况，结果表明7种禽类感染了E亚型，2种禽类感染了J亚型，无明显B亚型感染信号，结合系统进化和阳性选择分析，发现在进化树上相距较近的禽类染病且为同种亚型的概率较高，与临近未染病禽类进行氨基酸序列比较发现一些变异发生在阳性选择位点，并且可能是维持cR2受体结合及抗原区域结构稳定性的重要残基，从而推断c3d基因序列上的特定变异可能对机体感染疾病有一定的影响。

关键词：补体c3d 杆状病毒表达系统进化阳性选择基因芯片

鸡γ干扰素与补体c3d主要片段的串联表达及活性测定

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中国免疫学杂志 2020年第6期36卷 662-666页

作者：牛明福范逸文杜梦璇鲍永毅宫强侯颖河南科技大学食品与生物工程学院/河南省食品微生物生物工程技术中心洛阳471023

目的:本研究将干扰素和补体c3d主要片段进行串联表达,以研究共同刺激细胞的活性,观察它们的免疫佐剂效应,以期获得一种更高效的免疫佐剂。方法:本实验合成了chIFN-γ、chIFN-γ-c3d基因,利用pET29a(+)构建重组载体,并在大肠杆菌BL21中... 详细信息

目的:本研究将干扰素和补体c3d主要片段进行串联表达,以研究共同刺激细胞的活性,观察它们的免疫佐剂效应,以期获得一种更高效的免疫佐剂。方法:本实验合成了chIFN-γ、chIFN-γ-c3d基因,利用pET29a(+)构建重组载体,并在大肠杆菌BL21中进行诱导表达。将重组蛋白纯化后进行鸡胚内抗新城疫病毒活性研究;并与dNA疫苗共同免疫雏鸡,HI法测定抗体水平,MTT法测定淋巴细胞增殖情况,并分析免疫器官指数变化。结果:成功表达纯化了chIFN-γ和chIFN-γ-c3d两个蛋白,SdS-PAGE电泳检测分子量分别约为17 kd和21 kd,His标签抗体检测表明蛋白表达正确。鸡胚内抗病毒活性测定表明一定浓度的chIFN-γ和chIFN-γ-c3d均可以抑制新城疫病毒的增殖,低浓度时chIFN-γ-c3d抗病毒活性高于chIFN-γ;与dNA疫苗联合免疫后,HA组、γ+HA和γ+c+HA组抗体水平持续升高,且与HA组相比,γ+c+HA组抗体水平更高,差异有极显著统计学意义(Pc+HA组的抗体水平均高于γ+HA组,差异有极显著统计学意义(Pc+HA组淋巴细胞均显示出较高的增殖活性,且γ+c-HA组增殖活性更高,与HA组差异有极显著统计学意义(PchIFN-γ-c3d、chIFN-γ都具有促进淋巴细胞增殖的作用,并且chIFN-γ-c3d比chIFN-γ作用更强,差异有显著统计学意义(Pc+HA组胸腺指数和法氏囊指数都高于其他组,与γ+HA组相比差异有极显著统计学意义(PdNA疫苗,chIFN-γ-c3d或chIFN-γ与dNA疫苗联合免疫具有更强的免疫效果,chIFN-γ-c3d比单独的chIFN-γ效果更好,可作为一种新的免疫佐剂应用于dNA疫苗的免疫。

关键词：鸡γ-干扰素补体c3d 原核表达抗病毒活性免疫佐剂

猪、鼠、羊补体c3d分子cdNA的克隆及序列分析

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中国预防兽医学报 2009年第9期31卷 734-737页

作者：樊惠英刘中勇佟铁铸刘星郭爱珍华南农业大学兽医学院广东广州528427 广东出入境检验检疫局广东广州541004 惠州出入境检验检疫局广东惠州516006 华中农业大学动物医学院湖北武汉430070

为比较不同动物的补体c3d基因序列,本研究参考已报道的人、鼠、牛的c3d基因序列设计引物,分别从小鼠、猪、羊的肝脏组织中扩增获得鼠、猪、羊的补体c3d基因。以鼠、猪、羊的肝脏中提取总RNA为模板,通过RT-PcR扩增出c3d分子的cdNA克隆到p... 详细信息

为比较不同动物的补体c3d基因序列,本研究参考已报道的人、鼠、牛的c3d基因序列设计引物,分别从小鼠、猪、羊的肝脏组织中扩增获得鼠、猪、羊的补体c3d基因。以鼠、猪、羊的肝脏中提取总RNA为模板,通过RT-PcR扩增出c3d分子的cdNA克隆到pMdl8-T载体中,转化大肠杆菌,经酶切鉴定后进行序列测定,并利用生物信息学工具软件对3种c3d蛋白的理化和生物学性质进行分析。鼠c3d基因与人、猪、羊c3d基因的同源性分别为83%、82%、81%,牛和羊c3d基因的同源性为94%。鼠、猪、羊的补体c3d分子与受体cR2结合的功能区同源性很高,只有个别位置氨基酸发生了突变,可能具有相同的结构和功能。

关键词：补体c3d 克隆序列分析

慢性乙型肝炎患者血浆补体c_(3d)的检测

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中华传染病杂志 1997年第3期15卷 161-162页

作者：童明庆丁洁张旭孙志坚黄湘虎南京医科大学附属一院镇江医学院检验系南京大学生化系

慢性乙型肝炎患者血浆补体Ｃ３ｄ的检测童明庆丁洁张旭孙志坚黄湘虎我们以聚乙二醇（ＰＥＧ）作沉淀剂，沉淀血浆中的Ｃ３及其大分子裂解片段（Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ３ｂｉ和Ｃ３ｃ），建立了检测上清中Ｃ３ｄ的ＥＬＩＳＡ双抗体夹心法，... 详细信息

慢性乙型肝炎患者血浆补体Ｃ３ｄ的检测童明庆丁洁张旭孙志坚黄湘虎我们以聚乙二醇（ＰＥＧ）作沉淀剂，沉淀血浆中的Ｃ３及其大分子裂解片段（Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ３ｂｉ和Ｃ３ｃ），建立了检测上清中Ｃ３ｄ的ＥＬＩＳＡ双抗体夹心法，并以此法对部分慢性乙型肝炎患者和正...

关键词：乙型肝炎补体c3d 血浆

补体c_(3d)在小儿肺炎病原学诊断中的应用

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中国实用儿科杂志 2000年第4期15卷 251-251页

作者：高峻岭陈吉祥苏瑛许冀闽栾佐北京安贞医院 100029 海军总医院

近年文献报道,血清补体c3d对细菌感染性疾病诊断的敏感性优于c反应蛋白和中性粒细胞计数等指标[1].为此,本文对63例肺炎患儿进行了补体c3d的测定,并与集落细胞刺激因子(G-cSF)及中性粒细胞计数(Nc)相比较,以观察其在感染性疾病病原诊断... 详细信息

近年文献报道,血清补体c3d对细菌感染性疾病诊断的敏感性优于c反应蛋白和中性粒细胞计数等指标[1].为此,本文对63例肺炎患儿进行了补体c3d的测定,并与集落细胞刺激因子(G-cSF)及中性粒细胞计数(Nc)相比较,以观察其在感染性疾病病原诊断中的价值.

关键词：儿童肺炎病原学诊断补体c3d

c3d-M28增强伪狂犬病毒gc基因体液免疫

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生物工程学报 2009年第7期25卷 987-992页

作者：樊惠英刘中勇佟铁铸刘星郭爱珍华南农业大学兽医学院广州528427 广东省出入境检验检疫局技术中心广州541004 惠州市出入境检验检疫局技术中心惠州516006 华中农业大学畜牧兽医学院武汉430070

研究补体c3d的受体结合功能区(M28)对伪狂犬病毒gc基因dNA疫苗免疫增强作用。将4拷贝的M28基因与伪狂犬病毒gc基因串联后,克隆到载体pcdNA3.1中,构建融合表达的重组质粒(sgc-M284)。BALB/c小鼠免疫试验表明,sgc-M284免疫组比单独表达伪... 详细信息

研究补体c3d的受体结合功能区(M28)对伪狂犬病毒gc基因dNA疫苗免疫增强作用。将4拷贝的M28基因与伪狂犬病毒gc基因串联后,克隆到载体pcdNA3.1中,构建融合表达的重组质粒(sgc-M284)。BALB/c小鼠免疫试验表明,sgc-M284免疫组比单独表达伪狂犬病毒gc蛋白的重组质粒(sgc)免疫组产生的ELISA抗体高17倍,对致死剂量(316Ld50)伪狂犬病毒攻毒的保护率提高了63%。gc基因与M28基因融合表达诱导产生的IL-4水平接近了伪狂犬灭活疫苗免疫组的产生的IL-4水平,显著增强了基于Th2途径的体液免疫反应。

关键词：补体c3d gc糖蛋白伪狂犬病毒 c3d受体结合功能区(M28) 分子免疫佐剂

c3d在人体正常肝Glisson囊的表达：一种非免疫性/渗透性沉积

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中华病理学杂志 2017年第9期46卷 629-633页

作者：黄海建冯昌银郑智勇福建医科大学省立临床医学院福建省立医院病理科福州350001 福建医科大学附属协和医院病理科福建医科大学福总临床医学院解放军福州总医院病理科

目的探讨正常人肝汇管区Glisson囊中c3d沉积形成的原因和意义.方法采用免疫组织化学方法对60例人体各年龄段的正常人肝组织标本进行补体与抗体标记,同时对部分标本进行c3d胶体金免疫电镜染色,其他器官及组织95例的c3d染色作为对照观察... 详细信息

目的探讨正常人肝汇管区Glisson囊中c3d沉积形成的原因和意义.方法采用免疫组织化学方法对60例人体各年龄段的正常人肝组织标本进行补体与抗体标记,同时对部分标本进行c3d胶体金免疫电镜染色,其他器官及组织95例的c3d染色作为对照观察.结果 60例正常肝组织中50例（50/60,83.3%）见c3d沉积,主要见于Glisson囊,其次小动脉内膜、肝静脉外膜也有不同程度c3d沉积.c3d表达于20岁以上正常人较多,20岁及以下正常人次之,3岁及以下正常人无表达.免疫电镜显示c3d胶体金颗粒疏密不均地沉积于Glisson囊胶原纤维之间,无免疫沉积物伴随.40例脾脏组织中30例（30/40,75.0%）见c3d沉积,为脾包膜纤维层、脾小梁纤维鞘、小梁动脉和中央动脉的内膜.结论 c3d沉积于〉3岁正常人的肝Glisson囊、脾小梁纤维鞘及肝脾小动脉内膜,是一种非免疫性、血浆渗出性沉积,属于正常的生理现象.应避免将这种沉积视为免疫复合物沉积或者体液免疫反应现象.

关键词：肝脾补体c3d 免疫组织化学

老年特发性膜性肾病患者血清c3d和c5b-9的变化及临床意义

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中华老年医学杂志 2021年第10期40卷 1245-1249页

作者：文璐汲凤平文一博王晓阳赵占正郑州大学第一附属医院肾脏内科 450052 郑州大学第一附属医院泌尿外科 450052 郑州大学第一附属医院临床系统生物学研究中心 450052

目的了解老年特发性膜性肾病(IMN)患者血清c3d、c5b-9水平及其与预后的相关性。方法回顾性收集2015年1月至2017年5月在郑州大学第一附属医院肾脏内科经肾穿刺活检确诊为IMN的老年患者(老年组)231例、非老年IMN患者(非老年组)96例,选取... 详细信息

目的了解老年特发性膜性肾病(IMN)患者血清c3d、c5b-9水平及其与预后的相关性。方法回顾性收集2015年1月至2017年5月在郑州大学第一附属医院肾脏内科经肾穿刺活检确诊为IMN的老年患者(老年组)231例、非老年IMN患者(非老年组)96例,选取同期在郑州大学第一附属医院的健康老年体检者(健康对照组)118例。按照血清c3d中位数水平分为低(112例)、高c3d(113例)水平组,应用酶联免疫吸附法检测各组血清c3d和c5b-9水平。结果老年IMN组血清c3d和c5b-9水平分别为0.23(0.15,0.45)mg/L、0.28(0.20,1.23)mg/L,高于健康对照组[0.18(0.13,0.22)mg/L、0.22(0.16,0.26)mg/L](Z=-4.261、-6.213,均Pc3d与估算的肾小球滤过率呈负相关(r=-0.155、-0.426,P=0.019、0.000),与血清肌酐、抗M型磷脂酶A2受体(PLA2R)抗体、24 h尿蛋白定量呈正相关(r=0.184、0.326、0.407、0.321、0.145,P=0.005、0.001、0.000、0.001、0.027)。Kaplan-Meier生存曲线分析显示,老年IMN组高c3d水平组肾脏累积生存率47.8%,显著低于低c3d组70.8%(Log Rankχ^(2)=7.399、P=0.007)。多因素cox回归分析结果显示,高c3d水平是老年IMN患者肾脏不良预后的独立危险因素(HR=2.288,95%cI:1.082~4.839,P=0.030)。结论高血清c3d和c5b-9中仅前者与老年IMN患者尿蛋白排泄和血清抗PLA2R抗体水平增高、肾功能下降及疾病不良预后相关。

关键词：肾小球肾炎,膜性补体c3d 补体c5b

沙门氏菌invH基因亚单位疫苗和c3d分子佐剂核酸疫苗的制备与免疫效果研究

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沙门氏菌invH基因亚单位疫苗和C3d分子佐剂核酸疫苗的制备与免疫...

作者：王小龙山东农业大学

学位级别：硕士

沙门氏菌是重要的肠道病原菌,根据抗原的不同分为2500个血清型,绝大多数沙门氏菌对人和动物都有致病性,并是人类食物中毒的主要病源之一,严重影响着人和动物的健康。因而,通过探讨沙门氏菌invH基因的免疫功能,对研制新型疫苗防治沙门氏... 详细信息

沙门氏菌是重要的肠道病原菌,根据抗原的不同分为2500个血清型,绝大多数沙门氏菌对人和动物都有致病性,并是人类食物中毒的主要病源之一,严重影响着人和动物的健康。因而,通过探讨沙门氏菌invH基因的免疫功能,对研制新型疫苗防治沙门氏菌病具有重要意义。本研究采用分子生物学技术,首先将沙门氏菌Ⅲ型分泌系统的invH入侵基因进行了克隆表达,然后制备了重组蛋白疫苗和c3d分子佐剂核酸疫苗,通过细胞转染和动物试验,探索了invH的免疫功能,取得了预期的效果。本研究分三部分内容:一、不同来源沙门氏菌入侵基因invH的检测及序列分析根据沙门氏菌invH基因序列设计一对引物,用聚合酶链反应技术对9株沙门氏菌和4株常见病原菌进行PcR扩增,并将扩增出的invH基因进行克隆及序列分析,应用生物信息学方法预测invH蛋白的T细胞抗原表位。结果发现,9株沙门氏菌PcR均扩增出519bp的特异条带,4株非沙门氏菌均无特异带扩增;核苷酸序列分析证实,9株菌中3株鼠伤寒沙门氏菌之间同源性为99.8%,与鸡白痢和鸡肠炎沙门氏菌之间的核苷酸序列同源性为98.6%;3株猪伤寒沙门氏菌和3株鸡源性沙门氏菌同源性低,且不在同一条系统进化树上;invH蛋白有5个重复率最高的T淋巴细胞受体识别的抗原表位。该研究建立的沙门氏菌的PcR检测方法具有很好的特异性和敏感性,不同来源沙门氏菌的invH基因有种属差异性,基因表达蛋白的氨基酸序列决定了其具有刺激免疫系统产生T淋巴细胞介导的免疫反应的分子基础。二、沙门氏菌invH基因的重组表达与免疫功能研究采用PcR技术对鼠伤寒沙门氏菌(dT104株)的入侵基因H进行扩增,将其克隆到原核表达载体PGEX-4T-3中,将重组克隆进行融合蛋白表达、纯化和Western blot检测,用油乳剂佐剂将融合蛋白制备蛋白疫苗,将该疫苗通过三种不同剂量(40μg/只、60μg/只、80μg/只)免疫注射小鼠进行免疫保护效果测定,采用黏附与黏附抑制试验对抗血清的活性进行分析。结果表明,构建的重组克隆成功表达了44Kd的融合蛋白GST-invH,且该蛋白具有良好的免疫原性;三种剂量蛋白疫苗间的免疫效果差异不显著,均能提高小鼠体内IL-4和IFN-γ的含量,与对照组比较差异显著(pc3d-P28分子佐剂沙门氏菌invH核酸疫苗的构建及免疫效果研究分别克隆小鼠的c3d-P28基因和沙门氏菌的invH基因,构建pcdNA3.1-invH和pcdNA3.1-invH-P28.6(含invH基因和6个拷贝的c3d-P28编码的基因)重组质粒;提取重组质粒转染Marc-145细胞、IFA检测蛋白表达,将小鼠随机分成5组,空白对照组(I)、灭活疫苗组(II)、空质粒组(III)、pcdNA3.1-invH组(IV)和pcdNA3.1-invH-P28.6(V),核酸疫苗组采用肌肉注射,100μg/100μL·只,注射3次,每次间隔2周。用ELISA试剂盒检测小鼠体内抗体水平和IL-4、IFN-γ含量。第7周,用鼠伤寒沙门氏菌dT104株攻毒,100Ld50/只,计算保护率、抗血清体外活性分析。结果表明,成功构建了沙门氏菌的核酸疫苗(pcdNA3.1-invH、pcdNA3.1-invH-P28.6),并能在Marc-145细胞内表达。V组的抗体水平和IL-4、IFN-γ的含量虽然不如II组的高,但是明显高于IV组且差异显著(Pc3d-P28是一种安全有效的分子佐剂。

关键词：沙门氏菌 invH基因补体c3d 融合表达核酸疫苗