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Piezo1调控LIPUS在牙周膜干细胞的内皮分化和血管生成中的作用研究

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Piezo1调控LIPUS在牙周膜干细胞的内皮分化和血管生成中的作用研究

作者：虎瑞重庆医科大学

学位级别：硕士

研究背景:LIPUS(Low-instensity Pulsed Ultrasound,低频脉冲超声)是近年来研究较多的一种利用声辐射力产生的机械刺激对细胞产生作用,进而发挥治疗效用的治疗手段,LIPUS能调节多种干细胞的生物行为能力,还可促进牙周膜干细胞(PDLSCs)... 详细信息

研究背景:LIPUS(Low-instensity Pulsed Ultrasound,低频脉冲超声)是近年来研究较多的一种利用声辐射力产生的机械刺激对细胞产生作用,进而发挥治疗效用的治疗手段,LIPUS能调节多种干细胞的生物行为能力,还可促进牙周膜干细胞(PDLSCs)成骨分化,从而促进骨缺损的修复再生。骨组织再生过程与周围微血管的新生关系密切,然而LIPUS在PDLSCs的内皮分化及其微血管形成过程中的作用及调控机制尚不清楚。目的:本研究的目的是研究LIPUS对炎症或非炎症状态PDLSCs的内皮分化及成血管作用的影响,以及机械敏感性离子通道Piezo1参与LIPUS对PDLSCs调控机制的研究。方法:第一部分:通过酶消化法分离健康年轻人恒牙牙周膜,获取牙周膜干细胞,进行体外培养,并对所获细胞的多向分化能力及干细胞表面抗原进行鉴定;CCK-8法比较牙周膜干细胞经不同浓度LPS刺激后的细胞增殖能力差异,筛选LPS的实验刺激条件。第二部分:RT-PCR检测筛查不同强度LIPUS刺激对成骨诱导培养基培养后的PDLSCs中ALP活性影响的最佳强度,以最佳强度为实验条件,茜素红染色进一步比较确认LIPUS处理与不处理的矿化差异。RT-PCR检测筛查不同强度LIPUS刺激对内皮诱导培养基培养的PDLSCs中CD31表达的最佳强度,以最佳强度为实验条件,经流式细胞术比较LPS刺激或不刺激时,LIPUS处理与不处理PDLSCs的CD31表达差异,采用相同设计分组,Martrigel基质胶体外成管试验检测诱导后的细胞的体外成管能力差异。第三部分:RT-PCR检测筛查:a.不同强度LIPUS刺激对内皮诱导培养基培养的PDLSCs中Piezo1表达差异;b.不同浓度Gs MTx4刺激对PDLSCs中Piezo1活性抑制的最佳浓度。以最佳强度以及浓度为实验条件,WB结果再次确认Gs MTx4抑制效果,免疫荧光进一步比较确认Gs MTx4刺激或不刺激时,LIPUS处理后Piezo1的表达差异。流式细胞术、免疫荧光和PCR检测比较Gs MTx4刺激或不刺激时,内皮诱导后的PDLSCs中CD31表达差异,采用相同实验分组设计,Martrigel基质胶体外成管试验检测诱导后的PDLSCs的体外成管能力差异。结果:第一部分:通过酶消化法成功获得形似纺锤状的人牙周膜干细胞,显著粘附生长;流式检测细胞表抗结果为CD73(99.99%)、CD90(99.99%)、CD105(57.64%)、CD31(0.2%)、CD45(0.27%);茜素红染色21天可看到明显矿化结节,油红“O”染色21天可看到细胞内脂滴形成;CCK-8结果显示经10μg/m L LPS刺激的牙周膜干细胞,增殖能力升高,PCR比较经10μg/m L LPS刺激的牙周膜干细胞与未经处理的细胞相比,能明显诱导PDLSCs的炎症状态,符合前人研究结果。第二部分:RT-PCR检测ALP的m RNA水平显示LIPUS处理PDLSCs后ALP的表达在强度为50 m W/cm处达峰值;茜素红染色表明PDLSCs经LIPUS处理后,形成的矿化沉积较对照组明显。细胞形态观察结果显示,在内皮诱导培养基中培养14天后的PDLSCs形态与HUVECs类似,状如鹅卵石样,RT-PCR检测CD31的m RNA水平显示LIPUS刺激对内皮诱导培养基培养的PDLSCs中CD31表达的最佳强度为50 m W/cm,表达变化趋势与之前ALP高度相似;流式细胞术表明LPS刺激或不刺激时,LIPUS处理后经内皮诱导的PDLSCs中CD31较未经LIPUS处理组表达升高,相同实验条件下,Martrigel基质胶体外成管试验表明,经LIPUS处理的实验组,形成的管腔更密集,管腔连接点更多,且长度更佳。第三部分:RT-PCR检测Piezo1的m RNA水平显示不同强度LIPUS刺激经内皮诱导培养基培养的PDLSCs后,在50 m W/cm的强度下Piezo1表达达到峰值;不同浓度Gs MTx4处理PDLSCs后,Piezo1活性在2μM浓度的Gs MTx4作用下抑制效果最明显。以最佳辐射强度以及最佳抑制浓度为实验条件,免疫荧光进一步比较结果显示PDLSCs经内皮诱导并且LIPUS处理后,Gs MTx4抑制组中Piezo1表达显著低于未抑制组。流式细胞术、免疫荧光和PCR检测PDLSCs经内皮诱导,LIPUS处理后的Gs MTx4刺激组,CD31表达水平显著低于未抑制组,相同实验处理下,Martrigel基质胶体外成管试验结果显示Gs MTx4刺激组的体外成管能力较未刺激组明显较差,管腔密度更低,血管连接点更少,血管长度更差。结论:本研究验证LIPUS可促进PDLSCs在炎症或非炎症状态下的体外内皮向分化及血管形成能力,且通过激活Piezo1

关键词：牙周膜干细胞 LIPUS Piezo1 内皮分化血管

组织光透明成像跟踪糖尿病小鼠缺血性脑卒中后血管结构功能变化

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组织光透明成像跟踪糖尿病小鼠缺血性脑卒中后血管结构功能变化

作者：王平福华中科技大学

学位级别：硕士

脑卒中所具有的高致死率和高致残率给个人、家庭和社会带来了严重负担,其中缺血性脑卒中占比高达88%。同时约1/3的脑卒中患者伴随有糖尿病,这些患者的死亡率更高,预后功能恢复更差,其根本原因在于糖尿病会引起血管功能障碍。糖尿病到底... 详细信息

脑卒中所具有的高致死率和高致残率给个人、家庭和社会带来了严重负担,其中缺血性脑卒中占比高达88%。同时约1/3的脑卒中患者伴随有糖尿病,这些患者的死亡率更高,预后功能恢复更差,其根本原因在于糖尿病会引起血管功能障碍。糖尿病到底是如何加重脑卒中损伤的,一直是本领域的研究热点。目前,关于糖尿病对脑卒中后血管变化的研究仅关注于某个时间点,缺乏对不同时期血管结构变化的跟踪观测;且现有研究主要集中在传统二维薄切片层面,无法获取血管网络结构。本文旨在通过建立一种堵塞微血管三维标识方法,进而探究糖尿病小鼠缺血再灌注不同时间后血管结构变化。主要研究内容如下:(1)糖尿病对缺血性脑卒中小鼠梗死体积的影响:建立1型糖尿病小鼠模型和短暂性缺血脑卒中模型,通过血糖监测、激光散斑成像、TTC染色、Neu N染色等从活体到离体两个层面验证了模型有效性。进而对糖尿病小鼠缺血再灌注不同时间(1天、3天、7天、14天)后的大脑梗死体积进行统计,结果显示,正常小鼠缺血性脑卒中后大脑梗死体积随时间先减少后增加,而糖尿病小鼠梗死体积逐渐增加,且在所有时间点糖尿病小鼠卒中后的梗死体积显著高于非糖尿病小鼠。(2)糖尿病对缺血性脑卒中小鼠血管结构的影响:结合尾静脉注射番茄凝集素(LEL)与葡萄糖转运蛋白1(anti-GLUT-1)免疫荧光标记,识别堵塞微血管;并从透明度、尺寸变化及标记兼容性等方面筛选出i DISCO+方法进行光透明,进而结合光学成像构建了堵塞微血管的三维标识方法,用于对正常/糖尿病小鼠缺血再灌注不同时间后的血管进行三维成像。结果显示,糖尿病小鼠的脑血管比正常小鼠的更为密集;发生短暂性缺血性脑卒中后,正常小鼠总血管和具有灌注功能的血管密度均呈现先减少后增加的趋势,而糖尿病小鼠总血管密度和具有灌注功能的血管密度则逐渐减少;正常小鼠和糖尿病小鼠堵塞微血管的密度均随缺血再灌注时间逐渐增加,其中糖尿病小鼠堵塞微血管密度更高。以上结果说明糖尿病会使脑卒中后血管损伤更严重,血管恢复更缓慢。(3)糖尿病对缺血性脑卒中小鼠血管功能及行为学的影响:首先,通过尾静脉注射伊文思蓝(EB)评估小鼠缺血再灌注不同时间后血管渗透性变化,并利用网格行走及转角测试评估小鼠的行为学变化。结果显示,正常小鼠缺血性脑卒中后EB渗漏面积随时间先减少后增加,而糖尿病小鼠则随时间持续增加,且糖尿病小鼠EB渗漏面积显著高于正常小鼠,表明糖尿病使小鼠脑卒中后血管渗透性显著增强;正常小鼠和糖尿病小鼠缺血性脑卒中后行为学在第三天表现最差,在第七天表现出一定程度的恢复,但糖尿病小鼠的行为学功能损伤更为严重。综上所述,本文建立了一种堵塞微血管的三维标识方法,为获取小鼠缺血性脑卒中后堵塞微血管的三维数据提供了重要手段;评估糖尿病对小鼠缺血再灌注不同时间后血管结构功能、梗死体积及行为学的影响,为糖尿病对小鼠缺血性脑卒中后不同阶段的影响提供了数据支撑。本工作不仅增加了对糖尿病如何加重卒中损伤的认识,也有望为发展针对糖尿病合并缺血性脑卒中的治疗策略提供数据参考。

关键词：组织光透明三维成像缺血性脑卒中糖尿病血管行为学

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新型沃顿胶脱细胞软骨支架抑血管效应的研究

新型沃顿胶脱细胞软骨支架抑血管效应的研究

作者：齐军中南大学

学位级别：硕士

目的:基于脐带沃顿胶制备新型脱细胞软骨支架,研究化学冻融法和消化冻融法沃顿胶脱细胞支架在体外和体内抑血管生成的效应。方法:(1)使用化学冻融法和消化冻融法制备沃顿胶脱细胞支架,以目前软骨组织工程中广泛应用的10%GelMA水凝胶支... 详细信息

目的:基于脐带沃顿胶制备新型脱细胞软骨支架,研究化学冻融法和消化冻融法沃顿胶脱细胞支架在体外和体内抑血管生成的效应。方法:(1)使用化学冻融法和消化冻融法制备沃顿胶脱细胞支架,以目前软骨组织工程中广泛应用的10%GelMA水凝胶支架作为对照,制作化学冻融法和消化冻融法沃顿胶脱细胞支架、10%GelMA水凝胶支架并观察大体形态,HE染色观察支架微结构,测定支架的密度、孔隙率、溶胀率、降解率等理化性质。(2)配制各组支架浸提液,通过细胞死活染色、CCK-8检测各组支架的生物相容性;各组支架复合HUVECs共培养,通过VEGF免疫荧光染色、CCK-8检测支架促HUVECs增殖的能力;通过Scratch实验、Transwell迁移实验检测各组支架浸提液促HUVECs迁移的能力;通过Matrigel小管形成实验检测各组支架浸提液促HUVECs成管化的能力;RT-q PCR检测各组支架复合HUVECs体外培养3d、7d的成血管相关基因表达情况;ELISA检测各组支架复合HUVECs体外培养3d时的VEGF蛋白表达情况。(3)制备三组支架埋入裸鼠皮下,1周、2周、3周后取材行VEGF免疫荧光染色,并通过RT-q PCR检测各组皮下包埋支架的成血管相关基因的表达情况。结果:(1)化学冻融法和消化冻融法制备的沃顿胶脱细胞支架大体观呈现奶酪色、疏松多孔状,有一定的韧性,10%GelMA水凝胶支架呈现透明胶冻状,有较强的粘性和一定的弹性;密度:10%GelMA水凝胶支架>化学冻融法沃顿胶脱细胞支架>消化冻融法沃顿胶脱细胞支架;孔隙率:消化冻融法沃顿胶脱细胞支架>化学冻融法沃顿胶脱细胞支架>10%GelMA水凝胶支架;三组支架的溶胀率无统计学差异;降解率:化学/消化冻融法沃顿胶脱细胞支架>10%GelMA水凝胶支架。(2)细胞死活染色显示各组支架浸提液培养的HUVECs均生长良好,无明显死细胞,细胞密度:10%GelMA水凝胶支架组>对照组>化学/消化冻融法沃顿胶支架组。CCK-8检测各组浸提液培养HUVECs存活率均大于75%,各组支架生物相容性良好。各组支架复合HUVECs共培养3d、7d,VEGF免疫荧光染色显示化学和消化冻融法沃顿胶脱细胞支架的阳性面积显著小于10%GelMA水凝胶支架(P0.05);24h时,化学冻融法组和消化冻融法组的细胞迁移率均小于10%GelMA水凝胶组(P血管样网络,而在化学冻融法组和消化冻融法组只能观察到一些不明显的管状结构形成。定量分析显示各组成管的节点数、网眼数、总主干长度均存在统计学差异(P血管相关基因Ang-1、VEGF、CD31、HIF1-α、e NOS明显高于化学冻融法组(P血管相关基因Ang-1、VEGF、CD31、HIF1-α、e NOS明显低于10%GelMA水凝胶组(P血管相关基因表达随时间增加,化学冻融法组和消化冻融法组则没有随时间增加的趋势。各组支架复合HUVECs共培养3d,ELISA检测显示10%GelMA水凝胶组的VEGF蛋白表达水平最高,显著高于化学冻融法组(P<0.001)、消化冻融法组(P<0.001)和对照组(P<0.001);而化学冻融法组、消化冻融法组的VEGF蛋白表达水平最低,显著低于10%GelMA水凝胶组(P<0.001)和对照组(P<0.001)。(3)裸鼠皮下包埋支架VEGF免疫荧光染色结果显示2周、3周时,化学和消化冻融法沃顿胶脱细胞支架的阳性面积显著小于10%

关键词：沃顿胶组织工程血管水凝胶支架

艾灸联合化疗调控肿瘤免疫—血管微环境的抑瘤作用机制研究

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艾灸联合化疗调控肿瘤免疫—血管微环境的抑瘤作用机制研究

作者：鲁珊珊天津中医药大学

学位级别：硕士

目的:肿瘤免疫抑制微环境和血管异常是化疗药影响化疗药抗癌作用不利的重要影响因素。在本团队前期的单中心、小样本的临床研究发现艾灸双侧足三里和肺俞可增强化疗药对非小细胞肺癌患者的客观缓解率和疾病控制率。基础研究结果表明艾灸... 详细信息

目的:肿瘤免疫抑制微环境和血管异常是化疗药影响化疗药抗癌作用不利的重要影响因素。在本团队前期的单中心、小样本的临床研究发现艾灸双侧足三里和肺俞可增强化疗药对非小细胞肺癌患者的客观缓解率和疾病控制率。基础研究结果表明艾灸Lewis肺癌小鼠双侧足三里联合化疗在有效抑制肿瘤生长基础上,可改善肿瘤免疫和血管正常化相关指标。本研究将进一步研究肿瘤微环境介导艾灸联合化疗抑瘤的作用通路及分子机制:通过复制前期艾灸联合化疗改善肺癌小鼠肿瘤生长的效应平台,以肿瘤免疫微环境和血管正常化为切入点,更全面深入地研究艾灸联合化疗抑制肿瘤生长的作用通路及分子机制,以期促进艾灸协同化疗在肺癌患者中的临床转化,并为艾灸在更多瘤种应用、与靶向及免疫疗法的联合应用中提供理论依据和研究范式。方法:1.艾灸联合化疗抑制Lewis肺癌小鼠肿瘤生长的效应研究选用C57BL/6小鼠制备Lewis肺癌模型,将荷瘤成功的小鼠随机分为肿瘤组（T）、肿瘤+化疗组（TC）、肿瘤+艾灸组（TM）、肿瘤+化疗+艾灸组（TCM）,肿瘤+化疗+假艾灸组（TCSM）5组。化疗药顺铂剂量选用3mg/kg,每周两次,共2周;艾灸干预选用双侧足三里,与注射顺铂同一天开始,每周连续干预5次,共2周。于荷瘤后第7天、10天、14天、17天和21天测量肿瘤的长短径,计算肿瘤体积,通过绘制肿瘤生长曲线动态观察肿瘤体积大小,观察艾灸联合化疗的抑瘤效应。2.艾灸联合化疗抑制肿瘤生长的的机制筛查及验证研究将肿瘤组（T）、肿瘤+化疗组（TC）、肿瘤+艾灸组（TM）、肿瘤+化疗+艾灸组（TCM）小鼠的肿瘤总RNA进行基因测序检测,将组间差异P＜0.05且|Fold Change|＞2的基因判定为差异基因,应用现代生物信息学分析方法KEGG、GO富集和蛋白互作（Protein-protein interaction,PPI）分析各组间差异基因。首先将组间差异基因通过生信富集工具构建前30的KEGG和GO富集图,同时分析基因测序结果中KEGG通路列表中富集系数排名靠前的通路,最终筛选出免疫微环境和肿瘤血管正常化的相关通路和基因。再将差异基因进行PPI分析,分析出PPI网络中的高节点数基因。通过以上分析,再结合高质量文献,确定出关键基因。利用RT-q PCR技术,对筛选出来的关键基因进行验证。基于艾灸联合化疗对免疫通路的影响,利用液相芯片蛋白定量技术检测肿瘤组织免疫相关细胞因子。3.艾灸联合化疗调控肿瘤免疫微环境的机制研究选用C57BL/6小鼠制备Lewis肺癌模型,将荷瘤成功的小鼠随机分为肿瘤组（T）和化疗+艾灸组（TCM）。化疗药顺铂剂量选用3mg/kg,每周两次,共2周;艾灸干预选用双侧足三里,与注射顺铂同一天开始,每天1次,每周连续干预5天,共2周。于荷瘤后第7天、10天、14天、17天和21天测量肿瘤的长短径,通过绘制肿瘤生长曲线,动态观察肿瘤体积,观察艾灸联合化疗的抑瘤效应,并称量取材瘤体重量作为次要指标。利用流式细胞术检测肿瘤和脾脏中的免疫细胞亚群,并用RT-q PCR对免疫相关细胞因子进行基因定量验证。***-γ介导艾灸联合化疗抑制肿瘤生长的作用研究选用C57BL/6小鼠制备Lewis肺癌模型,然后将Lewis肺癌荷瘤小鼠随机分为肿瘤组（T）、肿瘤+化疗组（TC）、肿瘤+化疗+艾灸组（TCM）,肿瘤+化疗+艾灸组+IFN-γ中和抗体（TCM+XMG1.2）共4组。化疗药顺铂剂量选用3mg/kg,每周两次,共2周;艾灸干预选用双侧足三里,每天1次,每周连续干预5天,共2周;IFN-γ中和抗体XMG1.2肿瘤内注射,隔日一次,一周3次,共2周,于荷瘤后第7天、10天、14天、17天和21天测量肿瘤的长短径,计算肿瘤体积,通过绘制肿瘤生长曲线动态观察肿瘤体积大小,并以瘤体重量为次要指标,观察各组的抑瘤效应。结果:1艾灸足三里联合化疗可抑制Lewis肺癌小鼠肿瘤生长。从肿瘤生长曲线看,荷瘤后第14天,艾灸联合化疗的肿瘤大小较肿瘤组（p＜0.05）、单纯艾灸组（p＜0.05）生长缓慢,说明在该时间点艾灸联合化疗抑制肿瘤有效;且第17天艾灸联合化疗与肿瘤组比较,抑瘤效应仍存在优势（p＜0.05）;荷瘤后第21天（经治疗2周后）,艾灸联合化疗组小鼠肿瘤体积仍小于较肿瘤组（p＜0.01）、单纯艾灸组（p＜0.05）,艾灸联合假艾灸组小鼠肿瘤体积始终与肿瘤组无统计学差异,提示艾灸联合化疗可有效抑制肿瘤生长,假艾灸无效。2艾灸联合化疗可一定程度改善肿瘤免疫抑制状态和促进血管正常化。将肿瘤组织进行基因测序检测,并将组间差异基因进行现代生物信息学分析,KEGG通路富集分析结果表明,艾灸联合化疗组与肿瘤组比较,差异基因富集的通路主要是T细胞受体信号通路、NK细胞介导的细胞毒性、趋化因子信号通路、细胞因子-细胞因子受体互作、To

关键词：艾灸化疗 IFN-γ 免疫血管肺癌

GPX4依赖的铁死亡在血管衰老中的作用及机制

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GPX4依赖的铁死亡在血管衰老中的作用及机制

作者：孙迪阳中国人民解放军海军军医大学

学位级别：硕士

背景:血管衰老是人类衰老的重要方面之一,与人体整体的健康息息相关。血管衰老始于生命早期,从临床角度来看,它可以定义为一个逐渐发展的过程。其特征是血管结构和功能的逐渐变化,导致动脉顺应性降低和动脉硬化增加以及血管机能的逐渐丧... 详细信息

背景:血管衰老是人类衰老的重要方面之一,与人体整体的健康息息相关。血管衰老始于生命早期,从临床角度来看,它可以定义为一个逐渐发展的过程。其特征是血管结构和功能的逐渐变化,导致动脉顺应性降低和动脉硬化增加以及血管机能的逐渐丧失,与各类心血管疾病(CVD)密切相关。血管衰老的机制包括氧化应激、基因组不稳定性、慢性低度炎症、端粒缩短和细胞衰老。细胞衰老是一种在各种压力下不可逆的细胞周期停滞状态,从最初作为体外现象的出现逐渐转变为体内衰老的细胞标志。血管平滑肌细胞(VSMC)作为血管结构的关键组成部分之一,其衰老会促进动脉粥样硬化的发生,并与其他疾病包括高血压、糖尿病等有很强的相关性。铁死亡是一种新型的、受调控的细胞死亡形式,于2012年被正式提出。不同于如凋亡和坏死等其他细胞死亡类型,其特征是亚铁(Fe)驱动的致死性脂质活性氧(ROS)的大量积累。虽然精确的信号转导尚未完全阐明,但已证实铁死亡受多层信号通路和程序的调节,包括抗氧化酶,脂质过氧化产物,能量的利用,线粒体功能,干扰素相关基因等。铁死亡有助于缺血或药物诱发的心肌病,急性肾功能衰竭和动脉粥样硬化。然而,人们对铁死亡在血管老化中的作用知之甚少,并且之前有研究中发现,衰老的血管上有铁的沉积,有脂质沉积,并伴有大量ROS生成,这恰恰与铁死亡的主要进程有着很高的相似度。因此我们课题组假设:铁死亡可能参与了血管衰老的过程。实验方法:临床样本:从临床上患颈动脉体瘤的中年患者(70岁)中获取正常颈动脉组织。动物水平上:使用两种衰老模型。一种是饲养C57BL/6J小鼠至24月龄作为自然衰老模型,另一种是使用血管紧张素2(Ang II,400ng/kg/min)+博来霉素(Bleo,40 ng/kg/min)联合刺激诱导形成血管应激衰老模型。并在应激模型上使用铁死亡抑制剂Liproxstatin-1探究铁死亡对血管衰老的影响;构建GPX4基因敲入小鼠评估铁死亡对血管衰老的影响。细胞水平上,使用人原代血管平滑肌细胞(h VSMCs)和小鼠主动脉血管平滑肌细胞系(MOVAS),分别构建复制型衰老和应激衰老模型开展研究。实验结果:1、自然衰老血管和应激诱导的衰老血管中存在铁死亡的激活。我们分别在组织和细胞衰老模型中进行铁死亡相关指标的检测。首先对比中年(70岁)受试者的颈动脉血管,发现促铁死亡因子ALOX15、ACSL4、Fe在老年受试者血管中均出现升高。其次在动物模型上,我们使用两种血管衰老模型,一种是自然衰老C57BL/6J小鼠(24月龄),一种是使用Angiotensin II(Ang II,400 ng/kg/min)+bleomycin(Bleo,40 ng/kg/min)诱导的血管应激衰老小鼠,发现与对照C57BL/6J小鼠相比,两种衰老小鼠血管中均出现铁死亡激活。在细胞模型上,我们同样使用两种细胞衰老模型,一种提取原代人血管平滑肌细胞(h VSMCs),并传代至35代形成复制型衰老细胞,另一种是在小鼠VSMCs中使用Ang II(0.1μM)+bleomycin(100 n M)诱导细胞应激衰老,两者与对照相比均出现铁死亡的激活。2、我们在小鼠VSMCs中给予铁死亡激活剂RSL3。结果发现,非细胞毒性剂量(0.5μM)的RSL3能够诱导VSMCs衰老。同时我们用诱导铁死亡细胞的培养液和衰老细胞的培养液分别加入到正常的VSMCs培养基中,结果表明铁死亡促进了VSMCs的衰老,而衰老的VSMCs似乎不能诱导铁死亡。3、我们在动物应激衰老模型上使用铁死亡抑制剂Liproxstatin-1,结果发现Liproxstatin-1阻断了小鼠血管中铁死亡,减少了血管氧化应激,减少了NAD损失,减轻了血管的重塑/硬化,抑制衰老表型并减缓血管衰老进程。4、我们在体外培养的小鼠VSMCs衰老模型上使用铁死亡抑制剂Liproxstatin-1,结果发现Liproxstatin-1阻断了VSMCs中铁死亡,减少了细胞中的不稳定铁池(LIP),降低了细胞中氧化应激,减少了NAD损失,并且减缓了细胞衰老进程。5、我们构建了GPX4基因敲入小鼠,并使用同窝出生的野生型(WT)小鼠作为对照。两组小鼠饲养24个月成自然衰老(24月龄),对比发现GPX4的敲入能够抑制老年小鼠血管中铁死亡,并且减缓了小鼠血管衰老进程、减少衰老相关的NAD损失以及减轻老年小鼠血管的重塑/硬化。6、在GPX4基因敲入小鼠和同窝出生的野生型(WT)成年小鼠中(8周龄)使用血管紧张素II(Ang II,400 ng/kg/min)和博来霉素(Bleo,40ng/kg/min)联合刺激,诱导形成血管应激衰老模型。对比发现GPX4的敲入能够抑制血管铁死亡,减缓小鼠血管应激相关的NAD损失以及减缓小鼠血管的

关键词：铁死亡血管衰老 VSMCs NAD+ senescence

运动训练通过调节RhoA/ROCK通路改善自发性高血压大鼠血管结构的研究

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运动训练通过调节RhoA/ROCK通路改善自发性高血压大鼠血管结构的...

作者：冯嘉鹏河北大学

学位级别：硕士

目的:本研究利用自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats,SHR)模型,选择早期开展中低强度运动训练的方法,探究运动训练对大鼠血压及胸主动脉结构的影响,同时探究运动训练通过调节Rho A/ROCK通路降低SHR大鼠血压的机制。方法... 详细信息

目的:本研究利用自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats,SHR)模型,选择早期开展中低强度运动训练的方法,探究运动训练对大鼠血压及胸主动脉结构的影响,同时探究运动训练通过调节Rho A/ROCK通路降低SHR大鼠血压的机制。方法:本实验研究对象为8周龄SHR和正常血压大鼠(Wistar-Kyoto rats,WKY)。按照随机化分组原则分为:WKY安静对照组(WKY-Sed)、WKY运动训练组(WKY-Ex T)、SHR安静对照组(SHR-Sed)、SHR运动训练组(SHR-Ex T)、SHR运动训练LPA注射组(SHR-Ex T-LPA),每组各7只。运动训练组将大鼠置于跑步机上进行16周中低强度的运动训练。大鼠在正式运动训练前测量一次基础血压,随后每周进行一次血压测量。16周的运动训练结束后,进行取材。制作胸主动脉石蜡切片进行HE染色,观察胸主动脉形态。通过免疫印迹(Western blot,WB)技术比较各组大鼠血管中Rho A表达水平。通过免疫荧光(Immunofluorescence,IF)技术比较各组大鼠血管中Rho A和ROCK2蛋白分布以及表达水平。结果:为期16周的运动训练结束后,WKY-Sed组和WKY-Ex T组大鼠收缩压与运动训练前相比无统计学差异(P>0.05),SHR-Sed组大鼠收缩压与WKY-Sed组相比明显升高(P血管中Rho A表达水平无明显差异(P>0.05),SHR-Ex T组大鼠血管Rho A表达水平与SHR-Sed组相比下降(P血管Rho A表达水平与SHR-Ex T组相比上升(P血管内皮细胞以及平滑肌细胞的细胞质中,SHR-Sed组大鼠血管中Rho A、ROCK2表达水平与WKY-Sed组相比升高,SHR-Ex T组大鼠血管Rho A、ROCK2表达水平与SHR-Sed组大鼠相比下降(P血管Rho A、ROCK2表达水平与SHR-Ex T组相比上升(P血管内皮光滑,平滑肌细胞排列规则,SHR-Sed组大鼠及SHR-Ex T-LPA组大鼠血管壁粗糙,平滑肌细胞排列紊乱,部分平滑肌增粗。SHR-Ex T组大鼠血管与前两者相比血管壁较光滑,平滑肌细胞排列更加规则。结论:中低强度运动训练可以降低SHR血压,同时改善高血压引起的血管重塑。中低强度运动训练降低血压与心血管保护的机制与抑制Rho A/ROCK信号通路相关。

关键词：高血压运动训练血管 RhoA/ROCK通路

附子多糖对深低温冻存血管线粒体凋亡通路调控机制的研究

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附子多糖对深低温冻存血管线粒体凋亡通路调控机制的研究

作者：钟郁佳遵义医科大学

学位级别：硕士

目的:通过建立深低温冻存大鼠腹主动脉模型,探讨深低温冻存过程中附子多糖(Fuzi-polysaccharide,FPS)对血管组织线粒体凋亡通路相关基因的调控作用。方法:将36只SD大鼠的腹主动脉随机分成6组,每组6只,即对照组、冻存模型组、FPS 0.1 mg/... 详细信息

目的:通过建立深低温冻存大鼠腹主动脉模型,探讨深低温冻存过程中附子多糖(Fuzi-polysaccharide,FPS)对血管组织线粒体凋亡通路相关基因的调控作用。方法:将36只SD大鼠的腹主动脉随机分成6组,每组6只,即对照组、冻存模型组、FPS 0.1 mg/ml 组、FPS 1 mg/ml 组、FPS 10 mg/ml 组和 FPS 20 mg/ml 组。冻存模型组及FPS各浓度组经程序性降温后液氮保存,1周后快速复温。用免疫组化法检测血管组织中细胞色素c(cytochrome c,Cyt-c)的表达情况;蛋白免疫印迹法(Western blot,WB)检测血管组织胞浆蛋白Cyt-c、第二个线粒体来源的胱氨酸酶激活剂(second mitochondria-derived activator of caspase,Smac)表达水平及总蛋白中半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-9(cysteine aspartic acid specific protease-9,Caspase-9)、B 细胞白血病淋巴瘤相关蛋白基因(Bcl-2-associated X protein gene,Bax)、B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)蛋白表达情况。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测血管组织Bax、Bcl-2 mRNA表达水平。对照组取材后立即进行上述指标的检测。结果:1.血管组织Cyt-c表达:Cyt-c在新鲜的血管组织鲜有表达;冻存模型组胞浆中着大量棕黄色,Cyt-c表达最高;与冻存模型组相比,FPS 10 mg/ml组与FPS20mg/ml组表达显著减少(P血管组织Cyt-c、Smac、Caspase-9、Bax、Bcl-2蛋白表达水平:与对照组比较,冻存模型组及FPS各浓度组Cyt-c、Smac、Caspase-9、Bax蛋白表达均上调,Bcl-2蛋白表达均下调;与冻存模型组相比,FPS 1 mg/ml组、FPS 10 mg/ml组与FPS 20mg/ml组Cyt-c、Smac、Caspase-9、Bax蛋白相对表达量均降低,其中FPS 10 mg/ml组表达量显著低于其他浓度组(P0.05)。3.血管组织Bax、Bcl-2 mRNA表达水平:与对照组比较,冻存模型组及FPS各浓度组Bax mRNA表达水平均增加(P血管组织细胞凋亡事件的发生。2.附子多糖可以通过对线粒体凋亡通路相关因子的调控起到对深低温冻存血管组织的保护作用。

关键词：附子多糖深低温冻存血管线粒体凋亡通路

组织透明化技术在外周神经血管系统的成像运用

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组织透明化技术在外周神经血管系统的成像运用

作者：黄海涛厦门大学

学位级别：硕士

高等生物器官是高度有序的组织,其三维结构与其功能息息相关,对组织样品进行三维、深层次的分析对了解组织器官病变十分重要。但生物组织内部存在着大量的光散射、光吸收物质,限制了对各组织进行三维成像。近些年已开发出多种组织透明... 详细信息

高等生物器官是高度有序的组织,其三维结构与其功能息息相关,对组织样品进行三维、深层次的分析对了解组织器官病变十分重要。但生物组织内部存在着大量的光散射、光吸收物质,限制了对各组织进行三维成像。近些年已开发出多种组织透明化方法,利用不同的透明化试剂尽可能地将组织内部的高散射、高吸光物质去除,达到光学意义上的“透明”化,打破了传统组织切片只能对组织样本局部观察的限制,能够对器官进行宏观,无死角的三维成像。本文通过比较不同组织透明化方法的效果,以探索适宜外周神经血管三维组织成像的组织透明化方法。本文的主要研究内容如下:(1)多种透明化方法比较:比较水溶性透明化方法CUBIC和FRUIT与有机试剂透明化方法IDISCO和BABB透明化程度差异,选择IDISCO和CUBIC方法进行后续实验。(2)水溶性方法和有机溶剂透明化方法成像效果比较:分别对CUBIC和IDISCO透明化成像效果进行比较,选择兼具良好透明效果和成像质量的IDISCO方法进行外周神经血管三维成像的运用探索。(3)外周神经血管三维成像:利用IDISCO透明化方法,对小鼠的肺、肝脏、脾脏、骨骼的神经血管进行三维成像。(4)组织透明化成像的运用:构建LPS诱导多器官损伤模型,对肺、肝脏进行三维组织成像,展示组织损伤过程中神经与血管的空间分布特征。

关键词：组织透明化 IDISCO 三维成像神经血管

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血管低温保存过程热应力

化工学报 2006年第6期57卷 1284-1289页

作者：赵刚程曙霞刘忠中国科学技术大学热科学和能源工程系合肥市红十字会中心血站安徽合肥230031 合肥市红十字会中心血站

通过数值模拟,结合前人实验结果,探索低温保存血管壁出现裂纹或断裂的机理;为血管低温保存的优化设计提供理论依据·使用有限差分方法求解焓法模型,自行编制程序,求解该非线性热-力耦合问题·得到了一般低温保存过程(降温-恒温-复温-恒... 详细信息

通过数值模拟,结合前人实验结果,探索低温保存血管壁出现裂纹或断裂的机理;为血管低温保存的优化设计提供理论依据·使用有限差分方法求解焓法模型,自行编制程序,求解该非线性热-力耦合问题·得到了一般低温保存过程(降温-恒温-复温-恒温)中血管壁内部瞬态温度场与应力场;研究了降温速率、复温速率、降温终止温度等因素对该应力场变化历史的影响·结合前人实验结果,指出降温阶段血管最大轴向压应力的出现并非是导致血管内外壁出现裂纹的决定因素;复温初始阶段拉应力的出现才是导致血管内外壁出现裂纹的真正因素;分步复温实质上并非是缓解或者减少热应力,而是复温至某个温度区间,在血管弹性恢复至一定程度后,使其得以安全承受原本在脆性温区内不能承受的拉应力.

关键词：血管低温保存热应力裂纹