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高通量血型基因分型技术的建立及应用

高通量血型基因分型技术的建立及应用

作者：叶延瑶第三军医大学

学位级别：硕士

研究背景与目的人类红细胞ABO血型系统是临床上最重要的血型系统。ABO的血型鉴定对临床输血安全和器官移植安全有着重要意义。ABO血型鉴定的传统方法主要是血清学方法,对A、B抗原进行鉴定,该类方法检测速度快,易于操作,价格低廉,但检测... 详细信息

研究背景与目的人类红细胞ABO血型系统是临床上最重要的血型系统。ABO的血型鉴定对临床输血安全和器官移植安全有着重要意义。ABO血型鉴定的传统方法主要是血清学方法,对A、B抗原进行鉴定,该类方法检测速度快,易于操作,价格低廉,但检测易受红细胞表面抗原活性、个体分泌状态以及微生物污染等因素的影响。自1990以来,血型基因被相继克隆,出现了基于DNA检测的ABO血型基因分型技术,极大的弥补了血清学方法的不足。但目前的人类红细胞血型基因分型的方法自动化程度不够高,不够灵活,速度慢,成本高,不适合中国人群使用。为此,建立一套全基因组自动核酸提取系统,同时采用不对称PCR-SSP技术和分子信标(molecular beacon,MB)检测技术,建立一种新的ABO人类红细胞血型基因分型技术具有重要的临床意义。目前发现的血型系统共有36个,其中常规检测的血型系统有2个。当输血时,患者被输入未检测到与本人血型系统不相合的血液制品,存在机体产生免疫性抗体的风险,特别是需要长期输血治疗镰刀性贫血,地中海贫血等疾病的患者。如果由于长期输入未检测血型系统的异型血就会产生相关抗体,最后导致无血可输。又如女性患者如输入异型血,可产生相应抗体,可导致新生儿溶血病或不孕不育症。因此,研制高通量的血型鉴定方法用于更广的稀有血型系统的检测迫在眉睫。本研究组扩展了前期建立的人类红细胞血型基因分型方法,建立起一种可同时检测Kell、Kidd、Duffy、Diego的高通量人类红细胞血型基因分型方法。研究方法本研究通过改进科室现有的汉密尔顿加样仪和赛默飞的核酸提取仪建立一套自动化全基因组核酸提取系统,对系统进行优化。验证提取系统对全血、白膜层和红细胞三种不同样本提取效果的比较,找到一种最佳的模式。通过NCBI查找ABO血型系统不同血型的SNP位点,针对查找位点设计不对称PCR-SSP引物,然后进行不对称PCR-SSP扩增,对扩增产物进行测序,针对扩增产物设计分子信标,然后将扩增好的产物加入已经准备好的每孔都有对应分子信标的黑色96孔检测板里,通过多功能酶标仪进行判读。最后通过研发设计编写人工智能软件,对酶标仪读取的结果进行分析,直接得出各样品的血型基因型。研究结果本研究针对不同液体性质采用不同的加样模式,有效地避免了样品之间的污染,避免了液体因模式不当引起的仪器挂珠,加样量不准等造成的结果误差。得到了提取纯度和浓度均高的全基因组核酸;本研究通过优化不对称PCR-SSP反应条件得到了单链靶标DNA;本研究通过优化分子信标检测条件,得到有显著差别的阴性结果和阳性结果,使得结果容易判别;本研究通过人工智能软件判读血型结果,使得快速准确地判读结果成为现实,避免了人为判读结果的繁琐和错误。采用此方法,96个测试可在5h内完成,该方法检测灵敏度低于n M,特异性为100%。结论本研究建立了一套目前国内高自动化、高通量、智能的人类红细胞血型基因分型技术,此技术可以检测ABO血型系统的A1、A2、O1、O2、B等位基因,可以检测21种ABO血型系统的血型基因型。该系统也可以灵活运用于检测如Kell、Kidd、Duffy、Diego等其他稀有血型系统。

关键词：血型基因分型分子信标 PCR-SSP

基于分子倒置探针的高通量Kidd血型基因分型

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基于分子倒置探针的高通量Kidd血型基因分型

作者：周水梅武汉大学

学位级别：硕士

背景:血清学方法是Kidd血型分型的传统方法。然而,这种技术存在一些局限性,无法满足对Kidd抗原分型日益增长的需求。本研究旨在开发一种基于分子倒置探针(molecular inversion probe,MIP)捕获技术的靶向二代测序(Next generation sequen... 详细信息

背景:血清学方法是Kidd血型分型的传统方法。然而,这种技术存在一些局限性,无法满足对Kidd抗原分型日益增长的需求。本研究旨在开发一种基于分子倒置探针(molecular inversion probe,MIP)捕获技术的靶向二代测序(Next generation sequencing,NGS)血型分型方法,以允许在一次运行中同时鉴定大量患者的Kidd血型。方法:提取基因组DNA后,使用MIP探针捕获靶标。然后,使用带有样品条形码和Illumina衔接子的引物通过聚合酶链式反应(PCR)扩增产物,之后使用Illumina Next Seq对样品进行测序。用序列特异引物引导的聚合酶链反应(PCR-SSP)和新建方法同时检测10例献血者样品的Kidd血型以确定新建立的方法是否能够有效检测JKA,JKB等位基因。然后用基于MIP的NGS方法和血清学方法检测100例样本并比较结果的一致性。结果:基于MIP的NGS血型分型方法检测10例样本的结果均与PCR-SSP所得结果相同,表明新建方法能够有效检测JKA,JKB等位基因。建立的基于MIP的NGS分型方法检测100例样本的基因分型结果与血清学方法检测结果一致率为100%。在100例随机样本中,Jk和Jk的频率分别为0.39和0.61,抗原频率符合其在东方人群中的分布规律。结论:基于MIP的NGS方法是一种可行的血型分析策略,允许进行大规模的Kidd血型检测。此外,将这种MIP方法扩展到新的血型系统只需要加入新的捕获探针。

关键词： Kidd血型二代测序分子倒置探针血型基因分型

用母亲血浆中的DNA进行胎儿血型基因分型:预防治疗胎儿和新生儿溶血病的一重大进展

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国外医学（输血及血液学分册） 2005年第4期28卷 371-374页

作者： Daniels C Finning K Matin P 何吉浙江省血液中心

1引言20世纪70年代以前,胎儿和新生儿溶血病(HDFN)是导致胎儿和新生儿发病率与死亡率的主要病因.HDFN常发生于Rh系统D抗原阴性(D-)的母亲,由针对D血型抗原(RH1)的免疫球蛋白G(IgG)抗体穿过胎盘,并促进D阳性(D+)胎儿红细胞的免疫破坏引起... 详细信息

1引言20世纪70年代以前,胎儿和新生儿溶血病(HDFN)是导致胎儿和新生儿发病率与死亡率的主要病因.HDFN常发生于Rh系统D抗原阴性(D-)的母亲,由针对D血型抗原(RH1)的免疫球蛋白G(IgG)抗体穿过胎盘,并促进D阳性(D+)胎儿红细胞的免疫破坏引起.这种抗体经常是在前一个婴儿分娩过程中对胎儿的D+红细胞产生免疫应答而形成的,可通过给D-母亲在分娩每一D+婴儿后短时间内注射抗-D免疫球蛋白来预防抗体的产生以减少HDFN的发生.此外,产前抗-D的预防可用来防止妊娠过程的免疫反应.但是HDFN还不能被消除,HDFN的发病率为1/21000.在英格兰和威尔士,每年大约有500个胎儿发生HDFN,其中25～30名婴儿死亡,每年至少20例在24孕周前发生自然流产.

关键词：母亲血浆 DNA 血型基因分型疾病预防胎儿新生儿溶血病

MALDI-TOF MS质谱技术在疑难血型标本鉴定中的应用

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中国输血杂志 2022年第9期35卷 923-928页

作者：李艾静李明浩杨佳璇陆琼沈伟郑皆炜金沙向东杨启修朱自严叶璐夷上海市血液中心上海200051

目的探讨基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术在临床疑难血型标本基因分型中的应用,为临床输血工作提供依据。方法3例标本均为上海地区医院送检至上海市血液中心的疑难血型标本,其中1号标本包含先证者及其父母血样。利... 详细信息

目的探讨基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术在临床疑难血型标本基因分型中的应用,为临床输血工作提供依据。方法3例标本均为上海地区医院送检至上海市血液中心的疑难血型标本,其中1号标本包含先证者及其父母血样。利用血清学方法对标本进行血型鉴定、直抗试验、意外抗体筛查及鉴定试验。利用由本实验室建立的MALDI-TOF质谱检测体系对标本进行血型基因分型。利用Sanger测序验证标本基因突变位点,并利用血清学或流式方法验证部分标本表型。结果血清学结果提示,1号先证者及其母亲、2号和3号标本均存在抗高频抗原抗体。MALDI-TOF MS质谱分型结果显示,1号标本先证者为Di(a+b+),其父为Di(a-b+),其母为Di(a+b-),2号标本为p,3号标本为Jr(a-)。3例标本测序结果与质谱分型结果一致。血清学结果提示,2号标本为p表型。流式结果提示,3号标本为Jr(a-)表型。结论首次将MALDI-TOF MS质谱技术应用于国内临床疑难标本血型基因分型。相较于PCR-SSP等分型手段,MALDI-TOF MS具备快速、高通量、高特异性等优势,有助于辅助开展疑难血型鉴定,并有助于稀有血型筛选等工作。

关键词：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱血型基因分型稀有血型疑难血型标本

RhD双群患者的血清学及分子生物学分析--附1例报道

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中国输血杂志 2023年第7期36卷 594-597页

作者：邵媛贾双双莫春妍廖志坚温机智张润青罗广平姬艳丽广州血液中心广州市血液安全重点实验室广州广东510095

目的对1名配血困难的RhD双群(double population,DP)患者进行血清学及分子生物学分析,解决其RhD血型鉴定及临床用血问题。方法用毛细管离心法分离患者红细胞,对近心端、远心端红细胞分别进行ABO和Rh血型鉴定,以及直接抗人球蛋白试验;对... 详细信息

目的对1名配血困难的RhD双群(double population,DP)患者进行血清学及分子生物学分析,解决其RhD血型鉴定及临床用血问题。方法用毛细管离心法分离患者红细胞,对近心端、远心端红细胞分别进行ABO和Rh血型鉴定,以及直接抗人球蛋白试验;对患者血浆进行不规则抗体筛选及鉴定以及交叉配血试验;采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)检测RHD基因合子型,采用序列特异性聚合酶链反应(PCR-SSP)进行RHD和RHCE基因型检测。结果血型鉴定的结果显示该患者血型为B型,RhD及RhCE的c和E血型抗原均为DP,直抗阳性,抗体筛查及鉴定结果显示血浆中含有抗-D;PCR-RFLP结果显示该患者RHD基因盒子型为D-/D-纯合子,即为RHD编码基因缺失型所致的RhD阴性;PCR-SSP的结果也显示该患者RHD编码基因外显子均缺失,RHD基因型为RHD*01N.01/01N.01,RHCE基因型为Ccee。结论本例患者在急救情况下输注了RhD阳性血液,之后被误判为RhD阳性血型,实则为RhD阴性血型。本中心在血型鉴定为DP时,利用分子生物学方法对患者进行了Rh血型准确鉴定,为该患者的精准临床用血提供了依据。

关键词： RhD抗原抗-D 血型基因分型交叉配血

732例全自动血型分析仪检测ABO血型结果不确定的分析

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中国输血杂志 2017年第9期30卷 1012-1015页

作者：张坤莲黄旭颖周助人李丽春章旭李晓丰李剑平辽宁省血液中心辽宁沈阳110044

目的探讨ABO血型检测结果不确定的原因。方法对2010-2016年应用全自动血型分析仪检测ABO血型结果不确定的732例血样进一步采用手工试管盐水法、吸收放散试验等血清学试验及血型基因分型方法进行检测。结果 717例(97.95%)采用试管法进一... 详细信息

目的探讨ABO血型检测结果不确定的原因。方法对2010-2016年应用全自动血型分析仪检测ABO血型结果不确定的732例血样进一步采用手工试管盐水法、吸收放散试验等血清学试验及血型基因分型方法进行检测。结果 717例(97.95%)采用试管法进一步检测能够确定ABO血型,其中抗-B减弱457例(62.43%),抗-A减弱171例(23.36%);不规则抗体115例(15.71%),确认抗-M 18例(2.45%)、抗-E 1例(0.14%)和抗-Le(b)1例(0.14%)。15例经血型基因分型检测确认ABw33型1例(0.14%)、Ax13B型1例(0.14%)、Bw型5例(0.68%)、Bel型2例(0.27%)、cis AB03型2例(0.27%)、cis AB06型1例(0.14%)、B(A)型1例(0.14%)、A型类孟买1例(0.14%)及ABO*004等位基因表达弱A抗原1例(0.14%)。结论抗-B、抗-A减弱及不规则抗体是全自动血型分析仪检测ABO正反定型不符的主要原因。沈阳地区中国人群中B亚型多于A亚型。对于全自动血型分析仪检测的ABO血型不确定的标本应用手工试管法及血型基因分型方法检测联合分析能够准确鉴定ABO血型。

关键词：血型 ABO亚型血型基因分型疑难血型鉴定

ABO^＊cisAB．03．1．1/ABO^＊ O．02．01．1基因型患者的血型检测及分析

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中国输血杂志 2012年第4期25卷 363-365页

作者：任思婳和予馨王林林马怡然刀尧中国医科大学临床医学系辽宁沈阳110001 中国医科大学附属第一医院输血科中国医科大学实验技术中心二部

目的明确ABO血型血清学实验发现的患者正反定型不符情况的血型基因型。方法因贫血申请输注红细胞悬液的糖尿病患者,ABO血型检测发现其正反定型不符,应用血型血清学实验A1和A2亚型的分型、T抗原检测以及血清不规则抗体检测方法判定其血... 详细信息

目的明确ABO血型血清学实验发现的患者正反定型不符情况的血型基因型。方法因贫血申请输注红细胞悬液的糖尿病患者,ABO血型检测发现其正反定型不符,应用血型血清学实验A1和A2亚型的分型、T抗原检测以及血清不规则抗体检测方法判定其血清学表型,ABO基因分型及测序技术判定其血型基因型。结果患者红细胞与花生血凝素不发生凝集反应,血清不规则抗体筛查阴性;患者红细胞与抗-A凝集,与抗-A1不凝集,患者血清与A1标准红细胞呈现较强凝集反应,与A2标准红细胞不发生凝集;EXON6 1条等位基因存在261G的缺失,EXON7序列非O等位基因出现700T/C,EXON7测序结果显示突变点为526C/G,646A/T,657C/T,700C/T,703G/A,771C/T,796A/C,829G/A,803G/C,930G/A。结论我们发现该患者血清学方法表现为A2B血型,基因分型为少见的ABO* cisAB.03.1.1/ABO* O.02.01.1。

关键词： ABO血型血型基因分型输血

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血型分子分型技术的进展和应用

临床输血与检验 2017年第5期19卷 530-536页

作者：赵桐茂美国国立卫生研究院(NIH)

1900年人类红细胞血型被发现，开启了免疫学的一个分支免疫血液学，使用经典的血清学方法检测血型。20世纪下半期，随着基因研究和分子生物学技术的快速发展，出现了分子免疫血液学，在分子水平研究血型抗原和血型基因的分子结构。21世... 详细信息

1900年人类红细胞血型被发现，开启了免疫学的一个分支免疫血液学，使用经典的血清学方法检测血型。20世纪下半期，随着基因研究和分子生物学技术的快速发展，出现了分子免疫血液学，在分子水平研究血型抗原和血型基因的分子结构。21世纪初整个生物医学领域进入了后基因组时代，一门新的血型基因组学（BloodGroupGenomics）学科应运而生，建立了以DNA为基础的血型分子分型技术。虽然红细胞凝集技术可以很好地检测常见血型抗原，但是对于鉴定比较复杂的抗原变异体，单独使用血清学方法能力有限，为此需要分子生物学技术作为一个辅助工具。本综述介绍血型分子分型技术最新进展及其在临床输血中的应用，其中包括一些分子遗传学和血型基因多态性的基础知识。

关键词：血型基因分型血型基因组学分子生物学技术

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番禺献血人群B亚型的筛查与基因分型研究

临床医学工程 2016年第8期23卷 1025-1026页

作者：谢敬文蓝文莉马伟文莫锦政黎淑贞广州市番禺区中心血站广东广州511400

目的随机抽取广州番禺地区的献血者开展B亚型筛查,了解该地区B亚型的分类特征。方法采用96孔微量板法,使用单克隆抗-A/抗-B血型定型试剂和人ABO血型反定型用红细胞定型试剂检测盒,对献血者样本进行ABO血型正反定型检测,凡是正定型凝集... 详细信息

目的随机抽取广州番禺地区的献血者开展B亚型筛查,了解该地区B亚型的分类特征。方法采用96孔微量板法,使用单克隆抗-A/抗-B血型定型试剂和人ABO血型反定型用红细胞定型试剂检测盒,对献血者样本进行ABO血型正反定型检测,凡是正定型凝集强度少于4+或正反定型不一致的样本,使用人源抗-A/抗-B、抗-H等试剂进行血清学亚型鉴定;采用PCR-SSP法对亚型样本进行基因分型。结果在13 028例B型样本中检出1例血清学B3亚型,发生频率约为0.008%(1/13 028),基因分型为杂合型B303/O2。结论本地区献血人群中存在B3亚型,使用PCR-SSP法能准确鉴定亚型的基因型。

关键词： B亚型 PCR-SSP 血型基因分型