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蟾皮抗肿瘤活性组分筛选及荷人结肠癌裸鼠淋巴道化疗的实验研究

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蟾皮抗肿瘤活性组分筛选及荷人结肠癌裸鼠淋巴道化疗的实验研究

作者：邹振玉中国人民解放军医学院

学位级别：硕士

研究背景：已知淋巴结转移是影响结直肠癌预后的重要因素之一，而目前的化疗主要是经血道的治疗，即使在药物的血浆峰值浓度，到达淋巴结内的药物浓度也很低。也许这就是部分化疗不敏感的原因。目前已有针对淋巴结转移的淋巴道化疗研究... 详细信息

研究背景：已知淋巴结转移是影响结直肠癌预后的重要因素之一，而目前的化疗主要是经血道的治疗，即使在药物的血浆峰值浓度，到达淋巴结内的药物浓度也很低。也许这就是部分化疗不敏感的原因。目前已有针对淋巴结转移的淋巴道化疗研究，采用临床常用化疗药如丝裂霉素、5-FU等。这些化疗药均有白细胞毒性，且对淋巴道有刺激作用，只能通过改变药物剂型达到靶向淋巴结、降低毒副作用的目的。笔者认为，理想的淋巴道化疗药物应高度抑制肿瘤细胞而较少伤害淋巴细胞。因此筛选新的高效低毒抗肿瘤药物是本研究的首要目标。研究表明，蟾蜍的化学成分在抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、增强机体免疫功能等方面具有突出作用，因而被用作抗癌治疗。但由于技术限制，目前将蟾衣进行粗提生产药物，通过静脉注射或口服治疗消化道肿瘤，疗效有限且毒副作用大。本研究拟采用新型中药组分分离技术获得蟾皮活性组分群，并进行深入筛选，以期获得高效低毒的有效成分，并建立可行的淋巴道化疗方法，探索治疗结直肠癌淋巴结转移的新策略。研究目的：从蟾皮提取的组分群中筛选高效低毒的抗肿瘤活性组分，建立淋巴道化疗的方法，探讨其在荷人结肠癌裸鼠淋巴道转移模型中，对结肠癌的治疗作用及其对内脏器官和免疫功能的影响。研究方法：1)以蟾皮组分高、中、低浓度(2、0.5、0.1μg/ml)溶液分别与HCT116人结肠腺癌细胞、BGC823人胃腺癌细胞、SW1990人胰腺癌细胞和人CIK细胞进行体外共培养;应用ATP-TCA技术检测不同组分对细胞的作用，筛选对肿瘤细胞抑制率高、对CIK细胞抑制率低的高效低毒活性组分。2)制备蟾皮高效低毒组分不同浓度(2.5、0.25、0.05g/L)的注射乳剂。3)将HCT116细胞接种于BALB/c裸鼠爪垫皮下，建立荷人结肠癌裸鼠爪垫肿瘤淋巴道转移模型。4)将48只荷瘤裸鼠随机分为6组，分别为：生理盐水组，单纯乳剂组，华蟾素注射液组，高、中、低剂量蟾皮组分实验组;各组致瘤第3天开始经爪垫肿瘤周围注射治疗(淋巴道化疗)，连续治疗18天，观察裸鼠活力、进食、体重、爪垫肿瘤及淋巴结转移情况;末次治疗后次日处死并完整解剖爪垫肿瘤和腹股沟、髂血管旁、肾门淋巴结;HE染色观察爪垫肿瘤和淋巴结转移情况，计算抑瘤率和淋巴结转移率。5)裸鼠处死前眼眶取血检测血常规和肝肾功能。6)无菌条件下摘取脾脏，称重并计算脾指数;分离并培养脾细胞。7)流式细胞术检测外周血及脾脏中NK细胞和B细胞比例。8)ELISA法检测血清及脾细胞培养上清中IFN-γ和IgG1含量。研究结果：1)HCT116、BGC823和SW1990细胞对蟾皮49组分的高、中浓度敏感(抑制率>70%)，人CIK细胞对蟾皮1、2、182组分的高、中、低浓度均不敏感(抑制率蟾素组和乳剂组(P蟾素注射液。4)高、中剂量组分明显促进骨髓造血功能并刺激外周血淋巴细胞增殖，作用强于低剂量组分和华蟾素注射液(P蟾素注射液均可增加脾指数，中剂量组分作用强于低剂量组分和华蟾素注射液(P蟾皮中存在对肿瘤细胞抑制率高，对免疫细胞抑制率低，即高效低毒的抗肿瘤活性组分。2)体内实验证实：从爪垫肿瘤周围注射蟾皮高效低毒组分乳剂，通过爪垫淋巴管进入裸鼠体内淋巴系统，可以明显抑制肿瘤生长和淋巴结转移，活跃造血功能，刺激免疫器官和免疫细胞增生，促进免疫细胞分泌细胞因子和抗体。这种方法具有临床应用前景，如瘤周组织注射，转移淋巴结内灌注，或与微创技术相结合进行肿瘤和腹腔转移淋巴结的局部治疗，可作为治疗结直肠癌淋巴道转移的新方法。

关键词：蟾皮药物筛选试验结肠癌淋巴转移淋巴道化疗

蟾皮提取物抗肿瘤谱效关系及其活性成分对乳腺癌细胞凋亡的初步探讨

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蟾皮提取物抗肿瘤谱效关系及其活性成分对乳腺癌细胞凋亡的初步探...

作者：孙璐璐蚌埠医学院

学位级别：硕士

目的:研究不同产地蟾皮中药材的高效液相指纹图谱与其抗肿瘤作用的谱效关系,揭示蟾皮药材抗肿瘤作用的“药效活性成分”及药效活性成分诱导乳腺癌细胞凋亡的初步探讨。方法:1.甲醇回流提取。***分析方法的建立及确证。2.1色谱条件色谱柱... 详细信息

目的:研究不同产地蟾皮中药材的高效液相指纹图谱与其抗肿瘤作用的谱效关系,揭示蟾皮药材抗肿瘤作用的“药效活性成分”及药效活性成分诱导乳腺癌细胞凋亡的初步探讨。方法:1.甲醇回流提取。***分析方法的建立及确证。2.1色谱条件色谱柱为Thermo ODS C18柱（150 mm×2.1 mm,3μm）;流动相为水（0.1%乙酸）-乙腈,梯度洗脱程序:0～2分钟,10%乙腈;2～15分钟,10%5%乙腈;15～25分钟,25%0%乙腈;25～60分钟,30%0%乙腈;60～65分钟,40%0%乙腈;65～80分钟,10%乙腈;体积流量0.2 m L·min-1。温度25℃,检测波长为296 nm,进样量为3μL。2.2标准品溶液制备准确称量各标准品粉末,放于10 m L容量瓶中,然后加甲醇稀释至刻度,超声使其溶解并混匀,得到相应浓度的各标准品溶液。再各准确量取各标准品溶液1m L,放于10 m L容量瓶中,加甲醇稀释至刻度,超声振荡使之混匀,作为混合标准品溶液。3.谱效关系分析。3.1对HPLC测定的10个产地的每个特征峰面积进行均数化,并处理成量化特征峰数据X=i峰的面积值/i峰平均面积值3.2蟾皮药材各特征峰主成分分析（PCA）3.3不同产地蟾皮药材图谱共有特征峰与抗肿瘤作用的皮尔森相关系数***试验测定肿瘤的增殖能力,集落克隆法检测药物处理五天后细胞集落形成情况。***单染检测药效成分作用于人乳腺癌细胞24 h后,细胞凋亡率;DAPI荧光染色法检测细胞的晚期凋亡;线粒体膜电位试剂盒（JC-1）检测乳腺癌细胞在给药24 h后细胞线粒体膜电位变化。6.免疫印迹（Western Blot）法测定各蛋白Mcl-1、Bax、Bcl-2、p-Akt、Akt、c IAP-1的表达水平。7.采用荷瘤裸鼠模型观察药效成分对乳腺癌细胞的抑制作用。8.实验数据以（?）±SD表示,运用SPSS 16.0软件进行统计分析,各组间采用Dunnette-t检验法进行显著性检验,以*P蟾皮提取物对MCF-7和MDA-MB-231细胞的增殖抑制率实验结果显示:10批不同产地蟾皮提取物对MCF-7和MDA-MB-231细胞的增殖抑制率较高。3.10批蟾皮药材各特征峰进行主成分分析（PCA）运用SPSS16.0软件得到主成分方差贡献率以及初始因子载荷矩阵,获得主成分分析贡献率和累积贡献率表（见表2）、初始因子载荷矩阵表（见表3）。表3中,主成分与对应峰位的相关系数由各个载荷量表示,通过将表3中的各组数据除以主成分中对应的根号下特征值,得到对应于主成分方程中各峰的系数,经计算可得主成分模型:F1=0.384X1+0.41X2+0.364X3+0.368X4+0.228X5+0.4X6+0.28X7-0.097X8+0.342X9;F2=0.066X1-0.121X2-0.276X3-0.181X4+0.259X5-0.161X6+0.492X7+0.641X8+0.354X9;其中F1、F2、表示2个主成分,X1、X2、X3……X9表示各个色谱峰（峰1、2、3……9）。F1是特征根最大、方差贡献率最大、信息量能表达全面的指标,而在F1的方程中X2和X6的系数较大,表明峰2和峰6的量在蟾皮药材的质量控制中有相对重要的作用。4.不同产地蟾皮药材指纹图谱共有峰与抗肿瘤作用的相关系数采用SPSS 16.0软件进行相关性分析,计算各特征共有峰与10批蟾皮药材对MCF-7和MDA-MB-231细胞增殖作用的pearson相关系数,9个特征峰中峰8与MCF-7和MDA-MB-231细胞抑制效果相关性较高,峰7与MDA-MB-231细胞抑制作用相关性较高。5.筛选出药效成分峰8（华蟾酥毒基）,选用华蟾酥毒基研究对MCF-7和MDA-MB-231细胞增殖作用结果显示:随着华蟾酥毒基浓度增加、作用时间延长,对人乳腺癌细胞的增殖抑制作用明显增强。根据华蟾酥毒基对人乳腺癌细胞增殖作用的影响,采用明显低于肿瘤细胞半数抑制浓度的华蟾酥毒基刺激细胞,观察肿瘤细胞集落形成,证明华蟾酥毒基对肿瘤细胞增殖抑制作用的影响。结果表明:随着药物浓度的升高,华蟾酥毒基对乳腺癌细胞集落的形成有明显的抑制作用。6.华蟾酥毒基诱导MCF-7细胞发生凋亡不同浓度的华蟾酥毒基作用于乳腺癌细胞24 h,PI单染结果显示:随着华蟾酥毒基药物浓度增加,细胞凋亡率呈逐渐增多趋势。DAPI荧光染色法检测细胞晚期凋亡,结果显示随着药物浓度的增加细胞核呈现出浓缩致密,核裂现象逐渐增多。JC-1试剂盒检测细胞线粒体膜电位变化,华蟾酥毒基给药组细胞同空白组细胞相比,红色荧光逐渐减弱,绿色荧光逐渐增强

关键词：蟾皮指纹图谱主成分分析谱效关系 PI3K/Akt

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蟾皮的化学成分研究

蟾皮的化学成分研究

作者：曹徐涛沈阳药科大学

学位级别：硕士

蟾皮为中华大蟾蜍(Bufo bufo gargarizans Cantor)的干燥皮,味辛、气凉、微毒,有清热解毒、利水消胀之功效,主治痈疽、肿毒,我国民间多用来治疗原发性肝癌、肺癌等,具有较好的临床效果。目前蟾皮已经开发成多种制剂,其水溶性成分制剂华... 详细信息

蟾皮为中华大蟾蜍(Bufo bufo gargarizans Cantor)的干燥皮,味辛、气凉、微毒,有清热解毒、利水消胀之功效,主治痈疽、肿毒,我国民间多用来治疗原发性肝癌、肺癌等,具有较好的临床效果。目前蟾皮已经开发成多种制剂,其水溶性成分制剂华蟾素注射液临床上用于消化道中晚期癌症,疗效确切。为了更好的开发和利用蟾皮,本论文对蟾皮的75%乙醇提取物的氯仿萃取部分和水层部分进行了化学成分的研究。利用大孔吸附树脂,反复硅胶柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱、半制备HPLC色谱、重结晶等手段进行化学成分的分离与纯化。共分离鉴定了19个化合物。从氯仿层中分离纯化得到胆甾醇(cholesterol, CPO)和11个蟾毒配基类化合物。11个蟾毒配基类化合物的结构为：脂蟾毒配基(resibufogenin, CP1)、华蟾毒精(cinobufagin,CP2)、蟾毒灵(bufalin, CP3)、远华蟾毒精(telocinobufagin, CP4)、蟾毒它灵(bufotalin,CP5)、去乙酰华蟾毒它灵(desacetylcinobufagin, CP6)、嚏根草苷元(hellebrigenin, CP7)、沙蟾毒精(arenobufagin, CP8)、日蟾毒它灵(gamabufotalin, CP9)、11β-羟基脂蟾毒配基(11β-hydroxylresibufogenin, CP10)、华蟾毒它灵(cinobufotalin, CP11)。化合物CP10和CP11为首次从中华大蟾蜍皮中分离得到;从水层中分离纯化得到7个化合物,鉴定其化学结构为：蟾蜍环酰胺D(bufogargarizanine D, CPJ1),脱氢蟾蜍噻咛(dehydrobufothionine, CPJ2),环(脯氨酸-甘氨酸)二肽(cyclo(Pro-Gly)dipeptide, CPJ3),环(丙氨酸-丙氨酸)二肽(cyclo(Ala-Ala)dipeptide, CPJ4),尿嘧啶(uracil, CPJ5),胸腺嘧啶(thymine, CPJ6),腺苷(gland glucoside, CPJ7)。其中化合物CPJ1为新化合物,化合物CPJ3-7为首次从中华大蟾蜍皮中分离得到。

关键词：中华大蟾蜍蟾皮化学成分结构鉴定蟾毒配基类水溶性成分

蟾皮中抗肿瘤小分子化合物的获取和抗肿瘤作用机制的研究

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蟾皮中抗肿瘤小分子化合物的获取和抗肿瘤作用机制的研究

作者：何国平第二军医大学

学位级别：硕士

第一部分蟾皮中抗肿瘤活性小分子化合物的获取和抗肿瘤作用机制研究研究背景和目的卫生部《2008中国卫生统计年鉴》中的资料显示,恶性肿瘤已经成为严重危害我国人民生命健康的首要因素,尤其在大城市中,其死亡率占所有死因构成比的28.8... 详细信息

第一部分蟾皮中抗肿瘤活性小分子化合物的获取和抗肿瘤作用机制研究研究背景和目的卫生部《2008中国卫生统计年鉴》中的资料显示,恶性肿瘤已经成为严重危害我国人民生命健康的首要因素,尤其在大城市中,其死亡率占所有死因构成比的28.84%,对我国人民的生活和健康形成了极大的威胁。从世界范围内来看,恶性肿瘤也已经成为人类的头号杀手。尽管恶性肿瘤可以通过手术、化疗、放疗等手段部分根治或缓解,抗肿瘤药物的研发在过去的十多年也取得了长足的进步,但手术治愈率低、放化疗毒副反应严重使患者难于承受的局面没有根本改观,继续寻找特异性强、高效低毒的抗肿瘤药物,仍然是医学领域的研究热点。近年来,由于定向设计、合成先导药物及从组合化合物库中获得抗肿瘤药物前体愈来愈困难,并且化学药物相对毒副作用较强,所以人们已将目光转向天然药物。具有悠久历史并能有效治疗肿瘤的中药在医学界备受关注,经常作为放疗或者化疗的辅助方法。从中药中提取有效成分并将之开发成新药,是中药进入国际市场的一种有效方式。我国已在这一领域积累了一定的经验。从中药青蒿中研制出来的青蒿素及其衍生物的制剂,是目前治疗疟疾最好的药物,就是中药发展获得成功的一个典型。已经从蟾蜍中分离出来的单体化合物有蟾毒灵、华蟾蜍精醇等蟾蜍二烯内酯类化合物,临床中多作为强心剂使用,对其机制的研究也较为透彻。现代中药学研究表明蟾皮及其制剂治疗肝癌、肺癌等恶性肿瘤疗效确切。目前在临床上广泛应用的蟾蜍来源的抗肿瘤制剂主要有华蟾素注射液、华蟾素胶囊等。但是因为工艺粗糙,纯度不高,成分复杂,易导致毒副反应,且抗肿瘤机理不明,故其治疗价值受限;此外,已经从蟾皮及其制剂中分离出的有抗肿瘤活性的化合物多为脂溶性,对于蟾皮中的水溶性组分尚未见有深入的开发。本研究将采用生物检定导向的分离策略,借助于先进的分离纯化手段,对蟾皮水溶性组分进行了深入的分离纯化和活性研究,揭示蟾蜍中的药效组分对肿瘤细胞信号通路的调控作用,明确其抗肿瘤作用机理,为进一步开发天然抗肿瘤药物提供科学的理论依据及特异、有效的小分子药性化合物/先导化合物。实验方法: 1.利用工业色谱、高效液相色谱和纯化工厂技术平台对蟾皮的组分进行层层深入的分离纯化;2.采用CCK-8法对分离出的各级组分进行抗肿瘤活性鉴定;3.应用流式细胞术分析蟾皮活性组分对肿瘤细胞周期的影响;4.利用Western Blot和RT-PCR等分子生物学技术,初步探讨蟾皮活性组分调节肿瘤细胞中目的基因表达的情况;5.建立活体成像荷瘤小鼠模型,长期监测药效组分体内治疗效果。结果: 1.在蟾皮的4种工业色谱粗提组分中,Ⅳ号具有抗肿瘤活性;该组分在10-4mg/ml水平就表现出抑制肿瘤细胞增殖的效应,且随着浓度的升高而增强;2.在Ⅳ号粗提组分进一步分离出的11种初筛组分中,第11号(HCS411)具有抗肿瘤活性,且活性强于IV号组分;3.肝癌、肺癌、白血病和前列腺癌细胞对HCS411最敏感,乳腺癌、骨肉瘤和食管癌细胞较敏感,宫颈癌和结肠癌细胞不敏感;4.与正常肝细胞相比较,HCS411对肝癌细胞呈现一定的特异性;5. HCS411的抑制肿瘤细胞增殖活性较目前临床抗肿瘤常用的华蟾素注射液及顺铂均强;6. HCS411可以通过诱导G2/M期阻滞抑制肿瘤细胞增殖;7. HCS411抗肿瘤活性不依赖P53;8. HCS411经纯化工厂分离后得到60个精细组分,有7个有较强的抗肿瘤活性;其中以2-SX048429活性最强;9.荷瘤动物模型活体成像检测结果显示,2-SX048429活性成份在体内也有较强的抗肿瘤作用。结论: 本研究采用生物鉴定导向的分离方法,首次从蟾皮可溶性组分中逐步分离出了具有抗肿瘤活性的7个精细组分,为进一步发现抗肿瘤小分子化合物奠定了良好的基础;对其抗肿瘤机制进行的初步研究表明,这些组分可以通过不依赖于p53的方式使肿瘤细胞阻滞于G2/M期,进而抑制肿瘤细胞增殖。第二部分镍化合物通过调控细胞周期的致癌机制研究背景和目的肺癌是目前最常见的恶性肿瘤之一,也是全球发病率和死亡率增长最快的肿瘤。在世界大多数国家,肺癌的患病率和死亡率呈逐年上升的趋势,尤其是发达国家,肺癌在男性常见的恶性肿瘤中居首位。尽管目前对于肺癌的诊断和治疗方法较过去都有了很大改进,但肺癌的早期诊断困难、术后复发及转移率高等仍是临床研究的瓶颈问题。目前迫切需要从预防入手,从根源上控制这种对人类威胁极大的疾病。而要采取有效的预防措施,就必须深入了解肺癌发生的病因。虽然肿瘤的发生是环境因素和体内遗传因素相互作用的结果,但从总体上来看,环境因素是致癌的主要原因。据报导,80%0%的人类癌症与环境中的理化因素有关,其中又以化学因素致癌为主。重金属镍及其化合物就是其中一种主要的环境致癌物。流行病学资料显示,接触镍化合物与肺癌发病率的

关键词：蟾皮抗肿瘤活性小分子化合物分离纯化镍化合物致癌机制肺癌

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蟾皮和蟾蜕脂蟾毒配基含量测定与比较

时珍国医国药 2010年第4期21卷 879-880页

作者：缪珠雷张康杨鸣泽周秀佳上海中医药大学上海201203 江苏省海门市康平蟾衣制药研究所 226100

目的检测蟾皮及新发现的药用部位蟾蜕脂蟾毒配基含量并进行比较。方法HPLC检测蟾皮、蟾蜕中的脂蟾毒配基含量。结果蟾皮、蟾蜕中的脂蟾毒配基含量分别为0.011 7,0.031 3 mg/g。结论实验提示蟾蜕、蟾皮中均只有极微量的蟾毒配基残留。

关键词：脂蟾毒配基蟾皮蟾蜕

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蟾皮的化学成分与临床应用研究进展

时珍国医国药 2009年第5期20卷 1213-1214页

作者：王元清严建业喻林华中南林业科技大学生命科学与技术学院湖南长沙410004 湖南中医药大学药学院湖南长沙410007

蟾皮为蟾蜍科动物中华大蟾蜍Bufo bufo gargarizans Cantor或黑眶蟾蜍Bufo melanostictus Schneider的干燥表皮.蟾皮最早记载于,是蟾蜍去蟾酥、去内脏后晒干之物,经方入药目的多为以毒攻毒.现代医药学研究表明,蟾皮中存在多种化学成分[... 详细信息

蟾皮为蟾蜍科动物中华大蟾蜍Bufo bufo gargarizans Cantor或黑眶蟾蜍Bufo melanostictus Schneider的干燥表皮.蟾皮最早记载于,是蟾蜍去蟾酥、去内脏后晒干之物,经方入药目的多为以毒攻毒.现代医药学研究表明,蟾皮中存在多种化学成分[1],用于治疗小儿疳积、慢性气管炎、咽喉肿痛、痈肿疔毒等病症.近年来用于多种癌肿或配合化疗、放疗治癌,不仅能提高疗效,还能减轻副作用,改善血象[2].现就它的化学成分与临床应用研究进展作一综述.

关键词：蟾皮化学成分临床应用研究进展

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蟾皮的质量标准和指纹图谱及药代动力学研究

蟾皮的质量标准和指纹图谱及药代动力学研究

作者：段林瑞第四军医大学

学位级别：硕士

目的：蟾皮是中医临床常用中药。本课题就蟾皮的质量标准和指纹图谱及药代动力学进行了研究，目的在于建立蟾皮的中药材标准，明确蟾皮中的活性成分，阐明蟾皮的药代动力学规律，为蟾皮的开发和应用以及物效基础研究提供依据。方法： ... 详细信息

目的：蟾皮是中医临床常用中药。本课题就蟾皮的质量标准和指纹图谱及药代动力学进行了研究，目的在于建立蟾皮的中药材标准，明确蟾皮中的活性成分，阐明蟾皮的药代动力学规律，为蟾皮的开发和应用以及物效基础研究提供依据。方法： (1)蟾皮质量标准研究：通过理化性质、薄层鉴别等试验研究方法，检测水分、灰分含量，高效液相色谱法测定蟾皮中脂蟾毒配基和华蟾酥毒基含量，为制定蟾皮质量标准提供方法学支持。(2)蟾皮指纹图谱的研究：采用高效液相色谱技术(HPLC)，对10个不同产地蟾皮药材进行成分分析，结合9种已知的蟾蜍二烯羟酸内酯类对照品进行对照比较，分析各产地药材的共有峰，计算其相对保留时间(RRT)与相对峰面积(RPA)，结果运用相关系数法进行相似度评价，建立蟾皮药材的指纹图谱。(3)蟾皮抗肿瘤成分的药代动力学研究：分别对蟾皮中具有抗肿瘤活性的单体物质和蟾皮提取物进行药代动力学试验，灌胃给予大鼠适量脂蟾毒配基、华蟾酥毒基、蟾毒灵和蟾皮提取物，在给药后不同时间采集血液样本，利用高效液相色谱法检测血药浓度，结果用药代动力学软件处理，拟合药时曲线并得到相应的药代动力学参数。结果： (1)参照《中国药典》标准和要求，蟾皮药材质量标准的主要指标确定为，【水分】不超过12.0%;【总灰分】不超过14.5%;【酸不溶性灰分】不超过5.0%;【含量测定】华蟾酥毒基含量不低于0.02%，脂蟾毒配基含量不低于0.01%。(2)建立了蟾皮药材指纹图谱的检测方法，筛查出29个共有色谱峰，其中包括9种蟾蜍二烯羟酸内酯类化合物，分别为日蟾毒它灵(GBT)、沙蟾毒精(ABG)、远华蟾毒精(TCB)、去乙酰华蟾毒它灵(DCB)、蟾毒它灵(BFT)、华蟾毒它灵(CBG)、蟾毒灵(BFL)、华蟾酥毒基(CBG)、脂蟾毒配基(RBG);发现不同产地蟾皮药材的主要成分相似度较高，但其含量却存在较大的差异，其中陕西西安所产蟾皮药材中9种成分总含量最高(19.0μg/g)，山东济南所产蟾皮药材中9种成分总含量最低(5.2μg/g)，各地药材中，华蟾酥毒基的平均含量最高(2.13μg/g)，其余依次分别为蟾毒灵(1.45μg/g)、脂蟾毒配基(1.18μg/g)、蟾毒它灵(0.96μg/g)、日蟾毒它灵(0.82μg/g)、华蟾毒它灵(0.82μg/g)、去乙酰华蟾毒它灵(0.62μg/g)、沙蟾毒精(0.43μg/g)、远华蟾毒精(0.26μg/g)。(3)脂蟾毒配基、华蟾酥毒基灌胃给药后，大鼠体内未检测到原型，均以代谢产物的形式存在;蟾毒灵单体给药后药代动力学参数分别为AUC=975.89mg/L·min，AUC=1067.69mg/L·min， MRT=234.21min， MRT=608.08min，t=375.76min， Tmax=22.50min， CL=0.008L/min/kg， V(z/F)=3.51L/kg，C=4.66mg/L;蟾皮提取物给药后药代动力学参数分别为AUC=476.87mg/L·min，AUC=518.43mg/L·min，MRT=160.69min，MRT=221.46min，t=146.76min，T=26.25min，CL=0.023L/min/kg，Vz/F=4.56L/kg，Cmax=3.00mg/L;单体组与提取物组比较后得出AUC、AUC、MRT、MRT、t、T、CL、V、C等参数的P值分别为0.0279、0.0021、0.0045、0.0201、0.0246、0.5536、0.0029、0.3251、0.1894，可见两组在Tax、V和C方面无差异，而在AUC、AUC、MRT、MRT、t和CL方面有显著性差异。结论：蟾皮药材具有显著的地域性特点，不同产地药材中各蟾蜍二烯羟酸内酯类成分的含量存在较大差异;蟾皮提取物给药与蟾毒灵单体给药相比，能够有效地加快蟾毒灵在大鼠体内的代谢速率，缩短药物半衰期与平均滞留时间，减少曲线下面积，最终影响蟾毒灵在大鼠体内的吸收、分布、代谢与排泄。

关键词：蟾皮质量标准指纹图谱药代动力学

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蟾皮凝胶剂制备工艺及初步药效学研究

蟾皮凝胶剂制备工艺及初步药效学研究

作者：闾红燕浙江中医药大学

学位级别：硕士

目的蟾皮具有抗肿瘤和增强肿瘤患者免疫功能的双重作用且在临床已得到广泛证实,民间蟾皮外用早有报道,且疗效显著,本课题将蟾皮制成凝胶剂,对其处方前研究、处方筛选和制备工艺、质量标准及初步药效学进行系统的研究。方法处方前研究:... 详细信息

目的蟾皮具有抗肿瘤和增强肿瘤患者免疫功能的双重作用且在临床已得到广泛证实,民间蟾皮外用早有报道,且疗效显著,本课题将蟾皮制成凝胶剂,对其处方前研究、处方筛选和制备工艺、质量标准及初步药效学进行系统的研究。方法处方前研究:选取活蟾蜍取皮分别采用冷冻干燥和常规烘干干燥技术,以含水量为指标,干燥分别得到干蟾皮和鲜蟾皮。干燥后蟾皮采用超微粉碎技术,使细胞破膜,加速其有效成分的溶出。比较干蟾皮和鲜蟾皮有效成分含量以及抗肿瘤活性,系统评价两者含量和药理作用。处方筛选和制备工艺:对凝胶剂成型高分子材料进行初步筛选,以外观、黏度、涂展性、均匀度为指标筛选凝胶剂成型辅料卡波普、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯醇和羧甲基纤维素钠的用量,同时采用单因素和正交试验以体外皮肤透过量为指标筛选出最佳透皮促进剂的种类和用量,确定最终处方。筛选处方加入顺序,确定优化后制备工艺。质量标准:制备三批蟾皮凝胶剂样品,对华蟾酥毒基和脂蟾毒配基进行薄层色谱定性鉴别;在制剂含量测定中,选择高效液相色谱法测量鲜蟾皮凝胶剂中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基;体外透皮试验考察三批样品24h累计透过量。初步稳定性研究:对三批蟾皮凝胶剂样品进行影响因素考察、加速稳定性考察。初步药效学研究:以小鼠的抑瘤率为指标,同时考察小鼠免疫系统的胸腺指数和脾脏指数。结果处方前研究结果表明:蟾皮冷冻干燥为冷冻干燥机中(温度:-50±5℃,压强:20±5Pa)连续干燥18h后含水量符合要求。冷冻干燥后鲜蟾皮和常规烘干后干蟾皮连续超微粉碎5min,细胞破膜率达98.43%和95.22%。比较两者含量测定结果显示鲜蟾皮中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基总量按干燥品计算显著高于干蟾皮中含量,进一步药效学试验显示鲜蟾皮对S180腹水实体瘤荷瘤小鼠抑瘤率显著高于干蟾皮,故选择鲜蟾皮作为主药。处方筛选和制备工艺研究结果表明:最终确定蟾皮凝胶剂处方中各成分质量比为主药10%,成型基质HPMCK4M2%,HPMCK100M0.6%,透皮促进剂薄荷脑1%,氮酮3%,丙二醇1%,保湿剂甘油5%,防腐剂尼泊金甲酯0.1%,优化后处方制得凝胶剂外观均匀,黏度适中,涂展性好。质量标准研究结果表明:所得样品为半固体制剂,薄层色谱鉴别专属性强,采用高效液相色谱法对凝胶剂含量进行检测,色谱条件:色谱柱:kromasilC18(4.6mm×250mm,5μm)(瑞典);流动相:乙腈(A)-水(B)(48:52);流速:1mL·min-1;柱温:30℃;检测波长:296nm。实验条件下,测得蟾皮凝胶剂中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基总量不低于380μg/g,该测定方法简便易行,精密度、重现性良好。初步稳定性研究表明:影响因素考察研究表明高温因素对制剂稳定性存在一定的影响,需要在低温环境密封储存。制剂在低温条件下放置三个月,各项检测指标与“0月”比较,未见明显变化。初步药效学研究表明:蟾皮凝胶对S180腹水型实体瘤小鼠抑瘤作用研究,通过比较各组小鼠给药后的肿瘤抑制率情况,表明抑瘤率与给药剂量呈现正相关性;与模型组相比,高剂量组与中剂量组均具有显著性差异。结论本文完成蟾皮凝胶剂制备工艺、质量标准、初步稳定性及初步药效学研究,为该制剂提供了可靠的质量控制方法,也为今后进一步开展药物作用机理及产业化研究奠定了坚实的理论基础。

关键词：蟾皮凝胶剂制备工艺质量标准初步药效学

蟾皮提取物亲水凝胶骨架缓释片的制备及质量评价

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蟾皮提取物亲水凝胶骨架缓释片的制备及质量评价

作者：胡霞河北医科大学

学位级别：硕士

目的:蟾皮是蟾蜍科动物中华大蟾蜍Bufo bufo gargarizans Cantor或黑眶蟾蜍Bufo melanostictus Schneider的干燥表皮。因其提取物具有强心、抗肿瘤、局麻、镇痛、抗炎等作用而广泛应用于临床。但目前常用剂型如普通片剂、口服液、胶囊... 详细信息

目的:蟾皮是蟾蜍科动物中华大蟾蜍Bufo bufo gargarizans Cantor或黑眶蟾蜍Bufo melanostictus Schneider的干燥表皮。因其提取物具有强心、抗肿瘤、局麻、镇痛、抗炎等作用而广泛应用于临床。但目前常用剂型如普通片剂、口服液、胶囊剂及注射液等存在服药次数多,服药量大,口服有腥臭味,注射导致血管刺痛,引发静脉炎等弊端。因此,有必要研究一种新剂型,从一定程度上改善现有剂型的不足。亲水凝胶骨架片(Hydrophilic Matrix Tablet)是以亲水性聚合物或天然胶类为骨架材料制成的片剂。是缓控释口服固体制剂中最简单、性价比最高的剂型。通过骨架材料遇水或消化液膨胀,形成的凝胶屏障控制药物的释放。其制备成本低、生产工艺简单、机械化程度高、释药性能好、质量稳定、服用方便,占据了上市骨架片的60%0%。本课题拟采用羟丙甲纤维素(Hypromellose,HPMC)为骨架材料制备蟾皮提取物亲水凝胶骨架缓释片,以减少服药次数,减少毒副作用和耐药性的产生,增强患者用药的顺应性。方法:对蟾皮提取工艺进行研究。建立HPLC方法测定蟾皮提取物中华蟾酥毒基的含量。考察干蟾皮吸水率及浸泡时间,采用传统的水提醇沉法,以加水量、煎煮次数和煎煮时间进行三因素三水平的正交试验,依照L(3)正交表安排实验,以提取所得的浸膏量和其中华蟾酥毒基的含量为考察指标,采用综合加权评分法进行正交工艺的优选,筛选最佳提取工艺。并对筛选的最佳提取工艺进行验证。对蟾皮提取物进行质量评价。采用恒温水浴振荡法测定华蟾酥毒基在蒸馏水、pH6.8磷酸盐缓冲液、甲醇溶液中的溶解度。测定蟾皮提取物粉末的吸湿速率和临界相对湿度(Critical relative humidity,CRH),为药物的生产和贮存条件提供参考数据。采用薄层色谱法对提取物进行定性鉴别。采用HPLC方法测定提取物中华蟾酥毒基的含量。采用《中国药典》2005版溶出度测定第三法小杯法进行缓释片体外释放度测定。建立HPLC方法,以缓释片体外释放2、6、10h时华蟾酥毒基的累积释放度分别达到15%5%、40%0%、70%为评价指标,考察了HPMC的粘度、填充剂的种类、润湿剂的种类、HPMC的用量、致孔剂的种类、致孔剂的用量、制粒方法以及压片力大小等处方工艺因素和释放介质的种类、释放介质的体积和是否使用沉降篮等方法学因素。采用直观的图表数据分析和相似因子f2分析相结合的方法,对不同处方释放度数据进行比较。并考察缓释片颗粒的吸湿速率以及临界相对湿度。参照《中国药典》2005版二部XIXD缓释、控释制剂指导原则和二部附录IA片剂项下的有关要求,对蟾皮提取物亲水凝胶骨架缓释片进行质量控制,对其外观性状、薄层定性鉴别、片重差异等各规定项目进行考察,建立HPLC方法测定其中华蟾酥毒基的含量并计算其体外累积释放百分率,绘制累积释放百分率-时间曲线。将数据分别用Zero、First、Higuchi、Peppas模型进行拟合,并对药物的释放机理进行研究。结果:采用HPLC方法测定蟾皮提取物中华蟾酥毒基含量,其专属性好,方法可靠。干蟾皮吸水率为150%,即首次煎煮要多加1.5倍量的水,浸泡30min。水提醇沉法最佳工艺为蟾皮加水煎煮3次,第一次加入11.5倍量的水浸泡30min,煎煮45min,第二次和第三次均加入10倍量的水煎煮45min。蟾皮提取物浸膏在pH6.8磷酸盐缓冲液、甲醇、蒸馏水三种溶剂中的溶解度依次为3.2mg·ml,3.1 mg·ml,2.5mg·ml。蟾皮提取物浸膏在相对湿度为75%的环境中放置10d吸湿达到平衡,吸湿百分率为54.1%。其临界相对湿度为56.33%。薄层色谱结果显示,供试品色谱在与标准对照品色谱相对应的位置上,显示相同颜色的一个斑点,表明供试品中含有华蟾酥毒基这一成分。HPLC法测得蟾皮提取物中华蟾酥毒基的含量为1.53mg·g。缓释片处方工艺筛选的结果表明:骨架材料的粘度对药物释放有显著性影响,随着HPMC粘度的增加,药物释放速率减慢,含有三种不同粘度的HPMC缓释片的体外释放速率大小顺序为K4M>K15M>K100M。作为填充剂的乳糖和微晶纤维素对药物释放均有促进作用,淀粉对药物释放影响较小。4种不同润湿剂制备的颗粒的休止角均小于30°,其中90%乙醇溶液制粒容易,不粘筛,但细粉较多;50%乙醇溶液制粒稍困难,易粘筛;2%PVP乙醇溶液制粒较难,易粘筛,细粉较多;70%乙醇溶液制粒容易,不粘筛,细粉较少。当骨架材料HPMC K4M的用量为10%时,药物出现突释情况,用量范围在15%0%时,释药曲线相似。表明随着骨架材料用量的增多,释药速率减慢,但当用量达到一定范围后,再增加用量对药物释放影响不大。采用甘露醇作为致孔剂能提高药物释放度,药物释放速

关键词：蟾皮亲水凝胶骨架片缓释羟丙甲纤维素水提醇沉法华蟾酥毒基