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小RNA高通量测序检测蜱传病毒的初步研究

小RNA高通量测序检测蜱传病毒的初步研究

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作者：许肖枫中国农业科学院

学位级别：硕士

蜱是一种重要的人畜共患寄生虫,除叮咬吸血外,还携带病毒、细菌、立克次体、原虫等病原体,传播多种疾病。蜱传病毒种类丰富,组成复杂,且在蜱中普遍存在。随着经济发展与人类活动的增强,蜱媒病毒日益威胁人类与家畜健康。准确、快速、便... 详细信息

蜱是一种重要的人畜共患寄生虫,除叮咬吸血外,还携带病毒、细菌、立克次体、原虫等病原体,传播多种疾病。蜱传病毒种类丰富,组成复杂,且在蜱中普遍存在。随着经济发展与人类活动的增强,蜱媒病毒日益威胁人类与家畜健康。准确、快速、便捷的检测病毒对有效防控蜱传病毒病具有重要意义。随着高通量测序技术的飞速发展,许多研究利用宏基因组学来检测蜱传病原体。基于DNA测序的宏基因组学不能检测无DNA阶段的RNA病毒,为此基于转录组测序的方法被用于检测蜱传病毒。然而方法得到大量冗余宿主序列。与转录组测序分析相比,小RNA高通量测序检测病原的方法更灵敏。目前已成功用于检测蜱传立克次体与非洲猪瘟（ASFV）的DNA片段。该方法在检测RNA病毒方面更有优势,为此本研究在构建无脊椎动物传播病毒的本地数据库基础上,探索用小RNA高通量测序的方法检测蜱传病毒,并对部分检测结果进行了PCR验证。具体包括以下内容:1)通过整合NCBI病毒数据,建立了无脊椎动物传播的病毒本地数据库,为下一步提高小RNA高通量测序检测蜱传病毒的高效性与准确性奠定了基础。2)对云南采集的龟形花蜱,新疆采集的草原革蜱和银盾革蜱分别进行小RNA高通量测序。对测序产生的高通量原始数据进行处理与病毒检测。发现云南的龟形花蜱存在莫纳蜱病毒Mogiana tick virus和隐形病毒Stealth virus（AF191073）的小RNA片段。从新疆采集的革蜱中检测到以下病毒的小RNA片段:隐形病毒、蓝舌病病毒、非洲猪瘟病毒、科罗拉多蜱传热病毒、鹿流行性出血热病毒、非洲马瘟病毒、马脑炎病病毒、裂谷热病毒、水泡性口炎病毒、德黑兰病毒、Uukuniemi virus。3)通过PCR扩增并结合Sanger测序的方法验证了莫纳蜱病毒,证明小RNA高通量测序检测蜱传病毒方法的可行性。然后,结合Sanger测序与小RNA测序结果,获得莫纳蜱病毒的全长基因组数据,并将5′端和3′端非翻译区精准注释到1 bp。该结果在国际上首次证明了结合5′端和3′端小RNA的注释方法可以获得RNA病毒全长（full-length）的基因组完成图。4)采用PCR扩增与小RNA序列的深入挖掘与分析,确认Genbank上报道的隐形病毒（AF191073）鉴定错误,应为细菌Ochrobactrum quorumnocens的23S rDNA的部分序列。云南龟形花蜱、新疆草原革蜱与银盾革蜱若蜱均携带Ochrobactrum quorumnocens。同时也证明小RNA高通量测序除可检测病毒外,还可以检测到细菌的核糖体RNA。以上研究表明基于小RNA高通量测序的方法可用于蜱传病毒的检测,而且可以检测到多种病毒。此外,细菌等其他微生物也可以通过本方法检测。然而受测序深度的限制,是否能检测到全部病毒,或何种测序深度才能检测全面还需深入研究。

关键词：蜱病毒病毒数据库小RNA 病毒检测

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Characterization of Viromes of the Ticks in Central and Eastern China

Characterization of Viromes of the Ticks in Central and East...

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作者： SEONGJIN WANG 上海交通大学

学位级别：硕士

蜱是对人类和动物健康构成威胁的各种传染病的主要传播媒介。到目前为止,还没有发表过使用高通量二代测序研究中国东中部不同动物寄生蜱中病毒多样性的论文。本研究使用宏基因组学方法来揭示2017年和2018年蜱类病毒的多样性和丰富性。从... 详细信息

蜱是对人类和动物健康构成威胁的各种传染病的主要传播媒介。到目前为止,还没有发表过使用高通量二代测序研究中国东中部不同动物寄生蜱中病毒多样性的论文。本研究使用宏基因组学方法来揭示2017年和2018年蜱类病毒的多样性和丰富性。从犬,牛,山羊/绵羊和猪等宿主身上鉴定出四种蜱,包括血红扇头蜱、图兰扇头蜱、长角血蜱和黄血蜱。通过Miseq平台测序,在由258个蜱虫构建的40个蜱虫库中获得了15,020,533个高质量序列。修剪后得到7,578,983个序列,其中128,799个序列可以注释为病毒。属于ss RNA病毒的序列占93.08%（99,489/106,882）,属于ss DNA病毒的序列占3.67%（3,926/106,882）。多样性分析表明,与昌平蜱病毒2型（Changping tick virus 2）、伯乐蜱病毒3型（Bole tick virus 3）相关的大量非分类病毒的存在,似乎是区分类群间病毒多样性的重要因素。病毒谱分析研究表明,大多数病毒序列与未分类的病毒具有最接近的序列一致性。随后,与动物病毒中白纤病毒科（Phenuiviridae）、圆环病毒科,及植物病毒中的virgaviridae病毒重叠群序列相似病毒也被确定为第二常见的病毒序列。部分病毒序列与昆虫病毒、噬菌体和巨型病毒具有同源性。这些结果反映了寄主的饮食和生活习惯。对布尼亚病毒属的系统进化分析表明,已鉴定的重叠群与白纤病毒科（phenuiviridae,）,内罗病毒科（nairoviridae,）,泛布尼亚病毒科（peribunyaviridae）和未分类家族具有亲缘关系。但这些新发现的布尼亚病毒对人类和动物健康的意义还有待进一步研究。还确定了代表三个病毒科的大型重叠群,包括猪流感病毒科,细小病毒科和非分类家族。这些重叠群的一些序列与现有的病毒序列具有高度分歧的氨基酸特征。此外,我们还在警犬的蜱虫中发现了第一株犬圆环病毒,表明,蜱可以携带犬圆环病毒,而这种病毒可能是通过这些蜱为载体进行传播,这突出了它感染其他犬科宿主的能力。综上所述,我们的研究揭示了中国东中部蜱虫中存在多种病毒群落。我们的研究增加了对病毒多样性的了解,并扩展了对中国东中部蜱虫所携带的病毒谱的认识。

关键词：蜱宏基因组学生物信息学布尼亚病毒犬圆环病毒蜱病毒

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