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蛋白a亲和层析介质非特异性吸附的定量表征和关键组分鉴定

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蛋白A亲和层析介质非特异性吸附的定量表征和关键组分鉴定

作者：范春晖浙江大学

学位级别：硕士

蛋白a亲和层析是抗体药物分离的重要手段,对抗体吸附选择性高,但对杂质仍有一定程度的非特异性吸附,影响分离纯度、介质寿命及后续精制分离。本文针对蛋白a亲和层析介质的非特异性吸附,建立量化表征方法,考察多种介质和基质对不同料液... 详细信息

蛋白a亲和层析是抗体药物分离的重要手段,对抗体吸附选择性高,但对杂质仍有一定程度的非特异性吸附,影响分离纯度、介质寿命及后续精制分离。本文针对蛋白a亲和层析介质的非特异性吸附,建立量化表征方法,考察多种介质和基质对不同料液中杂质和关键杂质的吸附情况,探讨相关吸附机制。首先,针对料液中杂质总量的非特异性吸附,建立了定量表征方法,优化了操作条件。以牛血清白蛋白、酵母细胞培养液和CHO细胞培养液作为典型杂质,考察了五种蛋白a亲和层析介质和三种基质微球的非特异性吸附。结果表明,介质和基质对杂质均有一定程度的非特异性吸附,吸附规律有差异,吸附机制也有所不同,可通过静电、疏水或两者共同作用结合杂质。相较于酸性条件,多数介质和基质在中性和偏碱性条件下的杂质吸附较低,吸附指数A在0～0.4范围内波动。三种基质材料在pH 6～9范围内的杂质吸附无显著差异。琼脂糖基介质的非特异性吸附主要来源其基质,而两款聚甲基丙烯酸酯基介质的杂质吸附比例高于其对应基质。其次,针对关键杂质——宿主细胞蛋白,以CHO细胞培养液为典型料液,考察了三组蛋白A亲和介质与其基质材料的非特异性吸附。结果表明,介质和基质均可结合较高比例的宿主细胞蛋白,特别是在酸性和中性条件。加盐可有效降低非特异性结合,但两种聚合物基介质在过高盐浓度下对宿主细胞蛋白的吸附反而上升。介质主要通过其基质结合宿主细胞蛋白,但pH 9时,rProA和PA介质的宿主蛋白结合比例高于其基质微球。宿主细胞蛋白鉴定结果表明,不同介质/基质结合的宿主细胞蛋白有所不同,在CHO细胞培养液中共鉴定得到600种宿主细胞蛋白,23种可同时被三组介质和基质所吸附,包含参与CHO细胞生命活动的胞内蛋白至少有12种,以及关键宿主细胞蛋白T-复合蛋白亚基等。本文系统考察了多种蛋白a亲和层析介质和基质材料的非特异性吸附,得到了一些规律性认识,并探讨了相关作用机制,所建立的定量和定性表征方法和结果可为新型蛋白a亲和层析介质的设计和研发提供指导。

关键词：蛋白a亲和层析介质非特异性吸附杂质宿主细胞蛋白

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应用蛋白a亲和层析法纯化hCG单克隆抗体

应用蛋白A亲和层析法纯化hCG单克隆抗体

2010年中国药学大会暨第十届中国药师周

作者：沈泓易喻梅建凤朱克寅李敏应国清浙江工业大学药学院杭州博林生物技术有限公司

目的建立从小鼠腹水中纯化人绒毛膜促性腺激素（hCG）单克隆抗体的一步层析法。方法将hCG单克隆抗体的腹水经离心、过滤预处理后,采用HiTraprProteinAFF亲和层析柱纯化,并探讨了上样缓冲液的pH值和离子强度、洗脱液的pH值以及流速对抗... 详细信息

目的建立从小鼠腹水中纯化人绒毛膜促性腺激素（hCG）单克隆抗体的一步层析法。方法将hCG单克隆抗体的腹水经离心、过滤预处理后,采用HiTraprProteinAFF亲和层析柱纯化,并探讨了上样缓冲液的pH值和离子强度、洗脱液的pH值以及流速对抗体纯度及回收率的影响,纯化后的单克隆抗体的生物学活性用间接ELISA法测定。结果以pH7.0,20mmol/LPB+3.0mol/LNaCl为上样缓冲液,pH3.0,0.1mol/L柠檬酸缓冲液为洗脱液,流速为5.0ml/min时,hCG单抗的纯度大于95%,回收率达75%,纯化后的单克隆抗体的生物学活性没有下降。结论建立的蛋白a亲和层析法纯化hCG单克隆抗体的方法,操作简便、快速而且效果良好。

关键词：蛋白a亲和层析单克隆抗体人绒毛膜促性腺激素纯化

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应用蛋白a亲和层析法纯化hCG单克隆抗体

应用蛋白A亲和层析法纯化hCG单克隆抗体

亲和层析介质性能分析及其在单抗纯化中的应用

2009年中国药学大会暨第九届中国药师周

作者：沈泓易喻梅建凤朱克寅李敏应国清浙江工业大学药学院杭州博林生物技术有限公司

目的建立从小鼠腹水中纯化人绒毛膜促性腺激素（hCG）单克隆抗体的一步层析法。方法将hCG单克隆抗体的腹水经离心、过滤预处理后,采用HiTraprProteinAFF亲和层析柱纯化,并探讨了上样缓冲液的pH值和离子强度、洗脱液的pH值以及流速对抗体纯度及回收率的影响,纯化后的单克隆抗体的生物学活性用间接ELISA法测定。结果以pH7.0,20mmol/L PB+3.0mol/L NaCl为上样缓冲液,pH3.0,0.1mol/L柠檬酸缓冲液为洗脱液,流速为5.0ml/min时,hCG单抗的纯度大于95%,回收率达75%,纯化后的单克隆抗体的生物学活性没有下降。结论建立的蛋白a亲和层析法纯化hCG单克隆抗体的方法,操作简便、快速而且效果良好。

关键词：蛋白a亲和层析单克隆抗体人绒毛膜促性腺激素纯化

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药物生物技术 2012年第1期19卷 40-44页

作者：高栋缪仕伟王海彬姚善泾白骅浙江海正药业股份有限公司浙江台州318000 浙江大学浙江杭州310027

对6种商品化蛋白a亲和层析介质进行了性能分析,包括动态载量、洗脱条件等,并对含有单抗药物Mab-HS006的实际料液进行了捕获分离,对宿主细胞蛋白及蛋白A的残留进行了分析。结果表明,Prosep Ultra Plus和Mabselect SuRe亲和介质的载量最高... 详细信息

对6种商品化蛋白a亲和层析介质进行了性能分析,包括动态载量、洗脱条件等,并对含有单抗药物Mab-HS006的实际料液进行了捕获分离,对宿主细胞蛋白及蛋白A的残留进行了分析。结果表明,Prosep Ultra Plus和Mabselect SuRe亲和介质的载量最高,而Protein A Sepharose CL-4B和r-Protein A Sepharose的洗脱条件最温和。一步层析捕获分离Mab-HS006单抗的结果表明,各种介质的纯度均可达90%以上,Prosep Ultra Plus的宿主细胞蛋白残留最高,Mabselect SuRe蛋白A的脱落最低。

关键词：蛋白a亲和层析动态载量洗脱行为单克隆抗体纯化

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模型辅助的单抗连续捕获工艺分析和过程优化

化工学报 2024年第11期75卷 4274-4285页

作者：马烨玮孙艳娜高栋王海彬姚善泾林东强生物质化工教育部重点实验室浙江大学化学工程与生物工程学院浙江杭州310058 杭州博之锐生物制药有限公司浙江杭州311404

连续流层析具有提高过程产率和介质利用率、降低生产成本等显著优势,在抗体药物生产中具有良好的应用前景。但是,连续流层析模式多样,影响因素众多,传统的基于实验的过程开发方法存在困难。将模型辅助方法引入到连续流层析亲和捕获过程... 详细信息

连续流层析具有提高过程产率和介质利用率、降低生产成本等显著优势,在抗体药物生产中具有良好的应用前景。但是,连续流层析模式多样,影响因素众多,传统的基于实验的过程开发方法存在困难。将模型辅助方法引入到连续流层析亲和捕获过程,建立了模型辅助过程优化方法,系统比较了两柱、三柱和四柱连续捕获模式,确定了最佳模式和操作条件,并经实验验证。结果表明:模型预测与实验结果基本一致;与批次层析相比,四柱连续捕获的过程产率提高了27.2%,介质利用率提高了50.1%,且产品质量稳定。由此说明,模型辅助方法有助于确定最佳连续捕获模式和操作条件,促进过程优化,加速抗体药物连续生产过程的工业实现。

关键词：连续流层析抗体捕获模型辅助方法蛋白a亲和层析过程开发

人重组LIGHT-Fc分子的真核表达及其抗肿瘤活性研究

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细胞与分子免疫学杂志 2003年第5期19卷 499-502页

作者：黄钢白云姜曼黎万玲第三军医大学分子遗传学教研室重庆400038 第三军医大学免疫学教研室重庆400038

目的 :构建人LIGHT Fc基因的真核表达质粒 ,并表达获得有较高生物学活性的纯化人LIGHT Fc融合蛋白。方法 :从cDNA文库中PCR扩增LIGHT全长编码基因 ,并导入克隆载体。测序证实后 ,继续用PCR扩增其膜外区cDNA ,用重叠延伸技术(SOE)引入CD... 详细信息

目的 :构建人LIGHT Fc基因的真核表达质粒 ,并表达获得有较高生物学活性的纯化人LIGHT Fc融合蛋白。方法 :从cDNA文库中PCR扩增LIGHT全长编码基因 ,并导入克隆载体。测序证实后 ,继续用PCR扩增其膜外区cDNA ,用重叠延伸技术(SOE)引入CD137信号肽基因。将SOE产物与hIgG1Fc基因一起装入真核表达载体pcDNA3中 ,瞬时转染 2 93T细胞 ,用夹心ELISA检测其表达情况 ,经蛋白A亲和纯化 ,用SDS PAGE检测其纯度与Mr,并以肿瘤细胞为靶细胞 ,检测其生物学活性。结果 :测序证实构建的LIGHT与LIGHT FccDNA阅读框完整 ,连接部位序列正确 ;ELISA和SDS PAGE证实LIGHT Fc融合蛋白的表达与纯度 ;MTT证明人LIGHT Fc蛋白对一些肿瘤细胞系具有生长抑制作用。结论 :获得了有抗肿瘤活性的纯化hLIGHT Fc融合蛋白 ,为探讨LIGHT在免疫自稳调节中的地位、结合相应受体后的动力学与信号转导机制。

关键词：人 LIGHT LIGHT-Fc 信号肽重叠延伸蛋白a亲和层析抗肿瘤生物学活性

几种方法纯化小鼠腹水IgG2b类单抗的比较

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畜牧与兽医 2011年第1期43卷 48-50页

作者：杨威李小兵刘国文王哲孔涛张燚刘磊唐佳佳李东娜陈灰吉林大学畜牧兽医学院吉林长春130062

分别采用硫酸铵-蛋白a亲和层析法、改进后的硫酸铵-蛋白a亲和层析法、辛酸-硫酸铵-蛋白a亲和层析法纯化小鼠腹水IgG2b类抗体。经SDS-PAGE和间接ELISA分析纯化产物的纯度及其活性。结果表明:3种方法纯化后的单抗的免疫活性均未降低;纯化... 详细信息

分别采用硫酸铵-蛋白a亲和层析法、改进后的硫酸铵-蛋白a亲和层析法、辛酸-硫酸铵-蛋白a亲和层析法纯化小鼠腹水IgG2b类抗体。经SDS-PAGE和间接ELISA分析纯化产物的纯度及其活性。结果表明:3种方法纯化后的单抗的免疫活性均未降低;纯化后单抗的亚类为IgG2b;经改进后的硫酸铵-蛋白a亲和层析法纯化制备的IgG2b类抗体纯度可达到87.1%;经辛酸-硫酸铵-蛋白a亲和层析法纯化制备的IgG2b类单克隆抗体纯度可达到100%,是一种制备高纯度小鼠腹水IgG2b类单克隆抗体简便而有效的方法。

关键词：单克隆抗体 IgG2b 蛋白a亲和层析

人LIGHT-Fc的构建、表达及其抗肿瘤与共刺激活性的初步研究

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人LIGHT-Fc的构建、表达及其抗肿瘤与共刺激活性的初步研究

作者：黄钢第三军医大学

学位级别：硕士

LIGHT是一个新发现的TNF超家族成员，又名TNFSF-14或HVEM-L，为一29kD的II型跨膜糖蛋白，多以三聚体的形式诱导表达于活化的T细胞和选择性表达于未成熟树突状细胞上，是一个多功能多效应分子，根据靶细胞上表达的受体与T细胞所分泌的细... 详细信息

LIGHT是一个新发现的TNF超家族成员，又名TNFSF-14或HVEM-L，为一29kD的II型跨膜糖蛋白，多以三聚体的形式诱导表达于活化的T细胞和选择性表达于未成熟树突状细胞上，是一个多功能多效应分子，根据靶细胞上表达的受体与T细胞所分泌的细胞因子的不同而启动不同的生物学效应。目前发现LIGHT有三个受体：HVEM/TR2、LTβR和TR6/DcR3，均为TNFR超家族成员。其中HVEM/TR2组成性表达在未致敏T细胞表面，且在T细胞活化后表达水平有所下调;而LTβR只表达于基质细胞等非淋巴细胞以及一些肿瘤细胞的表面;TR6/DcR3则是缺乏跨膜区的一种可溶性的FasL诱饵受体，主要由胃、脊髓、结肠、淋巴结和脾脏以及肺和结肠来源的肿瘤细胞表达，而外周血淋巴细胞不表达。LIGHT-HVEM相互作用为T细胞的活化提供一个非CD28依赖性的共刺激信号，参与激活特异性CTL反应并诱导以IFN-γ和GM-CSF为代表的Th1型细胞因子分泌;LIGHT-LTβR相互作用通过接头蛋白TRAF激活死亡信号通路诱导肿瘤细胞的凋亡;TR6则作为可溶性诱饵受体通过竞争LIGHT配体，干扰或阻断LIGHT-HVEM及LIGHT-LTβR所引发的生物学效应，从而对免疫应答和免疫自稳进行调节，并可作为肿瘤的免疫逃逸手段之一发挥作用。现有研究发现LIGHT在淋巴器官的发生、肿瘤免疫、自身免疫病、移植排斥反应和抗病毒免疫中均发挥重要的作用。因为LIGHT兼具共刺激和细胞毒两方面的活性，有强大的抗肿瘤潜力，所以它很快成为免疫学研究的热点分子之一。为了深入探讨LIGHT的抗肿瘤机制及其它生物学功能，本研究拟克隆、构建并表达获得具有生物学活性的可溶性LIGHT-Fc蛋白分子，其意义在于：一方面，可溶性的 LIGHT-Fc结合受体后，在体内即可发挥诱导肿瘤细胞凋亡及对T细胞的共刺激活性，进而用于肿瘤免疫治疗，当条件成熟时，可被开发成一种治疗肿瘤的生物制剂;在另一方面，获得纯化的可溶性LIGHT-Fc蛋白，为进一步探讨LIGHT在免疫自稳调节中的地位、结合相应受体后的动力学与信号转导机制以及探索LIGHT的其它生物学功能奠定了坚实的基础。本研究主要进行了以下三部分的工作： 1. 人LIGHT全长cDNA的克隆、真核表达载体的构建及LIGHT-Fc的真核表达载体的构建。 ⑴ 采用PCR技术，从来自活化正常人T细胞的cDNA文库***扩增出编码人LIGHT全长240aa的cDNA序列，装入克隆载体后，经Amp抗性和蓝白斑筛选获得阳性重组子后，经测序证实同公布的LIGHTcDNA序列基本一致，编码氨基酸完全一致;⑵ 将全长LIGHT的cDNA片段从克隆载体上用EcoRI切下来，装入EcoRI线性化的真核表达载体pCI-neo和pcDNA3中，酶切鉴定出正向插入的阳性重组子，为从细胞水平研究LIGHT的功能奠定了基础;⑶ 应用SOE技术构建了带外源信号肽的重组LIGHT融合分子，并与hIgG1Fc一起装入真核表达载体pCI-neo和pcDNA3中，测序证实成功构建了LIGHT-Fc的真核表达载体，为进一步获得LIGHT-Fc融合蛋白打下了基础。 2. LIGHT-Fc蛋白的表达，纯化。 ⑴ 用脂质体法瞬时转染哺乳动物细胞，夹心ELISA证实有融合蛋白的表达;⑵ 蛋白a亲和层析纯化LIGHT-Fc蛋白，并用SDS-PAGE初步确定其单体的分子量和纯度。 3. 纯化LIGHT-Fc蛋白的生物学活性研究。 ⑴ 以A375，MCF-7，Hela和A549细胞为靶细胞，MTT法检测发现LIGHT-Fc蛋白对前三者有直接的生长抑制效应，而A549可能由于表达可溶性诱饵受体TR6，封闭了LIGHT对A549的直接细胞毒效应，从而发生免疫逃逸。总之，初步证实了LIGHT-Fc蛋白对肿瘤细胞的细胞毒效应。 ⑵ 夹心ELISA法检测了LIGHT-Fc蛋白对纯化人外周T淋巴细胞的共刺激效应，并能诱导IFN-γ等Th1型细胞因子的分泌。

关键词：人LIGHT PCR LIGHT-Fc 信号肽重叠延伸真核表达蛋白a亲和层析抗肿瘤细胞毒共刺激

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用于海洋弧菌快速检测的免疫磁珠技术的研究

用于海洋弧菌快速检测的免疫磁珠技术的研究

作者：郝华集美大学

学位级别：硕士

弧菌属细菌是海水鱼、虾、贝类的一种常见致病菌,由其引发的养殖病害每年为国家造成极大的经济损失。同时,弧菌属细菌中的一些种群也是引起人类急性肠胃炎的主要病原生物,它们可在人群中引起暴发性食物中毒,造成散发性米泔样腹泻和痢疾... 详细信息

弧菌属细菌是海水鱼、虾、贝类的一种常见致病菌,由其引发的养殖病害每年为国家造成极大的经济损失。同时,弧菌属细菌中的一些种群也是引起人类急性肠胃炎的主要病原生物,它们可在人群中引起暴发性食物中毒,造成散发性米泔样腹泻和痢疾等中毒症状。因此,检测海洋环境中病原弧菌对于保障人体健康和促进海水养殖业健康发展等都有着重要的意义。然而,目前检测病原弧菌的技术存在方法繁琐、耗时很长、集成度低等缺点,无法满足海洋监测的需要,因此亟需研发快速、简便、灵敏、集成度高的检测技术。?免疫磁珠(Immonumagnetic beads,IMB)分离技术是近年来国内外研究较多的一种新的免疫学技术,它具备了固相化试剂特有的优点以及免疫学反应的高度专一性等特点。本研究就是应用这种技术—免疫磁珠技术对病原性海洋弧菌进行快速检测,通过实验对检测过程中出现的各种理化因子进行优化,从而建立起实用、简便、准确的病原性海洋弧菌免疫磁珠快速检测体系。结果如下:1.本实验过程中通过耳缘静脉注射对新西兰大白兔进行免疫总共获得效价达到1:5120的兔抗鳗弧菌免疫血清210ml、1:5120的兔抗溶藻弧菌免疫血清150ml、1:2560的兔抗河流弧菌免疫血清230ml、1:2560的兔抗溶藻弧菌免疫血清190ml。为后续试验研究提供了大量高效价的免疫血清。2.通过免疫磁珠分离技术纯化实验室制备的兔抗血清中的IgG,并与A蛋白亲和层析法比较得出:抗体包被磁珠在10min就可以达到饱和,即100μL磁珠可以结合22.7μg IgG。两种方法得到IgG纯度都很高,经过SDS-PAGE电泳都只得到25KD和55KD左右的两条带;免疫磁珠分离法与A蛋白亲和层析法与以往的其他分离纯化方法相比具有反应时间短、操作简便、所得抗体纯度高、得率高等特点。其中免疫磁珠分离法得到的抗体ELISA效价(1:307200)高于A蛋白亲和层析法(1:256000);免疫磁珠分离法反应所需时间(10min)远小于A蛋白亲和层析法所需的20min,其得率(11.5mg/ml)也高于A蛋白亲和层析法的10.25mg/ml。3.初步建立了鳗弧菌检测的免疫磁珠技术,即:抗体包被磁珠的最佳浓度为40μg/ml,最佳反映时间为10min,包被好的磁珠与菌液最佳反映时间为20min。经测定免疫磁珠检测鳗弧菌的灵敏度高达0.13 CFU/ml。

关键词：弧菌分离免疫血清免疫磁珠蛋白a亲和层析抗体纯化