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植物乳杆菌WU146-磷酸-β-葡萄糖苷酶的基因克隆、蛋白表达及生物信息学分析

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中国食品学报 2022年第6期22卷 62-71页

作者：缪婷婷沈风飞张晓晓邱胡林徐波尹爱国石鹏君江西农业大学生物科学与工程学院南昌330045 广东石油化工学院生物与食品工程学院广东茂名525000 中国农业科学院农产品加工研究所北京100193

植物乳杆菌是一类兼性异养,兼性厌氧的同型发酵乳酸菌,其在改善食品风味和发酵特性等方面发挥着重要作用,而这种功能特征与其具有糖苷酶活性密切相关。为了挖掘植物乳杆菌糖苷酶的应用价值,以植物乳杆菌WU14为研究对象,利用聚合酶链式反... 详细信息

植物乳杆菌是一类兼性异养,兼性厌氧的同型发酵乳酸菌,其在改善食品风味和发酵特性等方面发挥着重要作用,而这种功能特征与其具有糖苷酶活性密切相关。为了挖掘植物乳杆菌糖苷酶的应用价值,以植物乳杆菌WU14为研究对象,利用聚合酶链式反应(PCR)技术成功克隆了8个WU14的糖苷水解酶,生物信息学分析表明均为糖苷水解酶1家族(GH1)的6-磷酸-β-葡萄糖苷酶基因。鉴于植物乳杆菌中该类糖苷酶鲜有报道,采用原核异源表达展开研究。序列分析表明8个酶蛋白氨基酸序列具有GH1家族的6-磷酸-β-葡萄糖苷酶典型的2个保守催化位点,序列一致性在32%~74%之间。经SDS-PAGE,8个蛋白均在大肠杆菌中表达,其中BglAW14、BglCW14、BglFW14为部分可溶性表达,其余为蛋白表达,形成包涵体。生物信息学分析显示:8个基因的编码蛋白都无信号肽和跨膜结构,疏水性较强。由亚细胞定位预测可知,除BglEW14主要存在于分泌结构内和BglHW14主要存在于细胞膜外,其余6个基因都存于细胞质内。对8个6-磷酸-β-葡萄糖苷酶基因的克隆表达及生物学序列分析,为进一步探究植物乳杆菌来源的6-磷酸-β-葡萄糖苷酶的分子机理研究奠定了基础。

关键词：植物乳杆菌WU14 6-磷酸-β-葡萄糖苷酶基因克隆蛋白表达生物信息学分析

柯里拉京调节巨噬细胞胆固醇代谢的作用及其机制

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中国药理学通报 2023年第9期39卷 1696-1704页

作者：邓欣孟达吴静宜姜丙通杨轶洋张雅琼赵毅黄丰车彦云云南中医药大学中药学院云南昆明650500 太原工业学院环境与安全工程系山西太原030008

目的探究柯里拉京(corilagin,Cor)调节巨噬细胞胆固醇代谢的作用及机制。方法采用分子对接技术,预测Cor调节胆固醇代谢的蛋白靶点。结合80 mg·L^(-1)氧化修饰型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoproteins,ox-LDL)诱导建立的RAW26... 详细信息

目的探究柯里拉京(corilagin,Cor)调节巨噬细胞胆固醇代谢的作用及机制。方法采用分子对接技术,预测Cor调节胆固醇代谢的蛋白靶点。结合80 mg·L^(-1)氧化修饰型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoproteins,ox-LDL)诱导建立的RAW264.7巨噬细胞泡沫模型评价其活性;采用实时聚合酶链式反应和免疫印迹方法检测胆固醇代谢相关基因和蛋白表达;并通过高脂饮食诱导ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)模型研究其活性及其机制。结果Cor与胆固醇代谢相关的A类清道夫受体(class A scavenger receptor,SRA)和CD36以及过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)和细胞膜上的ATP结合盒转运体G1(ATP binding cassette transporter G1,ABCG1)蛋白能形成氢键和疏水相互作用。细胞实验表明,Cor(60、120和240μmol·L^(-1))降低巨噬细胞内TC的含量,下调SRA的基因和蛋白表达,下调CD36的基因表达,并上调了ABCA1和ABCG1的基因和蛋白表达。动物实验表明,Cor(15、30和60 mg·kg-1)降低小鼠血清中的TMAO含量,减少主动脉根部的斑块形成,降低了主动脉根部斑块中CD36、SRA的荧光蛋白表达水平。结论Cor能够通过调节CD36、SRA、ABCA1和ABCG1介导的胆固醇代谢,抑制巨噬细胞泡沫化,发挥抗AS作用。

关键词：柯里拉京巨噬细胞胆固醇代谢基因表达蛋白表达动脉粥样硬化

γ射线对大鼠肝脏代谢酶CYP3A1的多水平影响

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中国药理学通报 2023年第3期39卷 463-469页

作者：张海晖董航赵丹阳叶彤孟志云朱晓霞顾若兰吴卓娜窦桂芳甘慧军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所北京100850

目的探究γ射线对肝脏核心药物代谢酶CYP3A1在mRNA、蛋白以及代谢活性多水平的影响。方法Wistar大鼠随机分为对照组、辐射后24 h组、辐射后72 h组。6 Gyγ射线单次全身辐射实验组大鼠,于辐照后24 h、72 h眼眶静脉丛取血,进行血常规检测... 详细信息

目的探究γ射线对肝脏核心药物代谢酶CYP3A1在mRNA、蛋白以及代谢活性多水平的影响。方法Wistar大鼠随机分为对照组、辐射后24 h组、辐射后72 h组。6 Gyγ射线单次全身辐射实验组大鼠,于辐照后24 h、72 h眼眶静脉丛取血,进行血常规检测与血生化分析;取肝脏组织,RT-PCR定量CYP3A1 mRNA以及肝脏特异性的microRNA(miR-122-5p),Western blot分析CYP3A1蛋白表达水平;利用特异性底物咪达唑仑与液质联用方法检测CYP3A1代谢活性水平。结果与对照组相比,辐射组大鼠体重明显降低;白细胞数量明显减少;谷丙转氨酶活性持续降低,碱性磷酸酶活性明显降低,总胆红素、总胆汁酸水平明显升高,表明辐射后大鼠肝脏可能受损。CYP3A1 mRNA相对表达量在辐射后24 h、72 h持续明显升高;CYP3A1蛋白表达及代谢活性水平在辐射后24 h呈现较明显的升高趋势,在辐射后72 h较对照组明显上升。同时,监测到辐射24 h组和72 h组大鼠肝脏miR-122-5p表达量快速且持续下降。结论γ射线辐射对肝脏可能具有一定的损伤作用,其造成肝组织中关键代谢酶CYP3A1在mRNA和蛋白表达水平的持续上调,以及代谢活性水平的升高,调控机制可能与miR-122-5p有关。

关键词： γ射线 CYP3A1 mRNA表达蛋白表达代谢活性 miR-122-5p

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一种新型的曲霉属洁净可逆性诱导表达系统

华东理工大学学报（自然科学版） 2023年第4期49卷 536-545页

作者：李宝意周胜敏华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室上海200037

构建了一种以构巢曲霉为表达宿主、过氧化氢(H_(2)O_(2))抗性酶Peroxiredoxin(PRX)的编码基因AnPrxA的启动子P_(PRX)为表达用启动子、H_(2)O_(2)为表达诱导剂的新型、高效的曲霉表达体系。在双氧水诱导和非诱导条件下,评估P_(PRX)的上... 详细信息

构建了一种以构巢曲霉为表达宿主、过氧化氢(H_(2)O_(2))抗性酶Peroxiredoxin(PRX)的编码基因AnPrxA的启动子P_(PRX)为表达用启动子、H_(2)O_(2)为表达诱导剂的新型、高效的曲霉表达体系。在双氧水诱导和非诱导条件下,评估P_(PRX)的上游调控区介导绿色荧光蛋白(GFP)表达的特征。利用基因工程构建了4个含不同长度启动子表达盒的克隆载体并转化至尿嘧啶生物合成缺陷型构巢曲霉宿主;分析了AnPrxA基因上游2033 bp序列中潜在的转录调控元件;利用荧光定量PCR测定表达盒拷贝数;考察与P_(PRX)融合的GFP表达情况;并且探讨了双氧水诱导浓度和作用时间与蛋白表达量的关系。结果表明,AnPrxA基因的5'-非编码区2033 bp序列中至少包含9种基因表达调控元件,大都呈多拷贝排列;虽然该2033 bp的非编码区域对gfp的转录均有贡献,但是非编码区缩短至500 bp也可以维持GFP蛋白的正常表达;在双氧水浓度为0.5~2.0 mmol/L的诱导条件下,P_(PRX)介导的GFP表达量提高3倍,与先前鉴定的2种曲霉属双氧水诱导型启动子的诱导率相似,但目标蛋白的绝对表达强度更高。研究还发现P_(PRX)介导gfp转录水平在H_(2)O_(2)诱导条件下提高30倍,显著高于其蛋白表达的诱导率(3倍),因此今后进一步提升蛋白翻译效率将有望大幅提高目标蛋白的合成水平。

关键词： PRX 蛋白表达构巢曲霉过氧化氢表达调控

克氏原螯虾Rab5、Rab6蛋白及其抗体对血淋巴细胞吞噬活性的影响

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水生生物学报 2022年第9期46卷 1285-1292页

作者：朱雷赵彤王欣茹蒋昕彧候利波孔祥会河南师范大学水产学院新乡453007

为研究克氏原螯虾(Procambarus clarkii)Rab5(PcRab5)和Rab6(PcRab6)的生物学功能,利用同源重组技术构建了克氏原螯虾pET-B2m-PcRab5和pET-B2m-PcRab6原核表达载体,并进行了诱导表达和多克隆抗体的制备,采用ELISA和Western Blot技术检测了抗体效价和特异性。将PcRab5和PcRab6的原核表达蛋白和多克隆抗体注射到健康克氏原螯虾体内,研究了其对血淋巴细胞吞噬活性的影响。实验结果表明构建的pETB2m-PcRab5和pET-B2m-PcRab6原核表达载体经诱导后可表达目的蛋白,分子量均为67 kD,纯化后蛋白条带单一,纯度较高。重组表达纯化后的PcRab5和PcRab6蛋白免疫日本大耳兔分别获得效价为1:2048 K和1:512 K的兔抗血清,制备的抗体可分别特异性识别PcRab5和PcRab6蛋白。将PcRab5和PcRab6蛋白注射健康克氏原螯虾后,其血淋巴细胞中可吞噬荧光微球的细胞比例分别显著上升至38%和30%(P蛋白参与了血淋巴细胞吞噬功能。实验为进一步研究克氏原螯虾PcRab5和PcRab6分子功能奠定基础,也可为理解甲壳动物Rab5和Rab6在血淋巴细胞吞噬功能中的作用提供帮助。

关键词： Rab蛋白同源重组蛋白表达抗体制备血淋巴细胞吞噬活性克氏原螯虾

牛支原体LRR5蛋白原核表达及其在牛支原体入侵宿主细胞过程中的作用分析

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微生物学报 2024年第5期64卷 1469-1482页

作者：冯雅茹周梦婷张瑜瑜张格高鹏程冉多良许健储岳峰李斌新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830052 新疆草食动物新药研究与创制重点实验室新疆乌鲁木齐830052 中国农业科学院兰州兽医研究所/兰州大学动物医学与生物安全学院、动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730000 甘肃省病原生物学基础学科研究中心甘肃兰州730046

致病性支原体具有入侵宿主细胞的能力,这是其发挥致病作用的关键。介导支原体入侵宿主细胞的自身功能蛋白可能是一种潜在的药物或疫苗靶标。【目的】克隆表达牛支原体(Mycoplasma bovis)MBOVPG45_0564基因编码蛋白(命名为LRR5蛋白),并... 详细信息

致病性支原体具有入侵宿主细胞的能力,这是其发挥致病作用的关键。介导支原体入侵宿主细胞的自身功能蛋白可能是一种潜在的药物或疫苗靶标。【目的】克隆表达牛支原体(Mycoplasma bovis)MBOVPG45_0564基因编码蛋白(命名为LRR5蛋白),并探究其在M.bovis入侵宿主细胞过程中的作用。【方法】利用NCBI数据库对MBOVPG45_0564基因进行同源性分析,用Discovery Studio Client系统对LRR5蛋白进行蛋白结构预测;原核表达LRR5蛋白并制备其小鼠多克隆抗体,利用免疫电镜对LRR5蛋白进行亚细胞定位;通过平板计数、激光共聚焦显微镜观察LRR5抗体封闭后M.bovis对胎牛肺(embryonic bovine lung,EBL)细胞入侵率的变化;将LRR5蛋白偶联至荧光微球表面后,以激光共聚焦显微镜及高内涵活细胞成像系统观察微球进入EBL细胞情况。【结果】MBOVPG45_0564基因在牛支原体属中为保守基因,其编码蛋白LRR5为膜相关蛋白,空间构象呈典型的月牙状,多个重复的亮氨酸基序以超螺旋方式组装并形成螺线管蛋白质结构单元。LRR5抗体封闭后,M.bovis对EBL细胞的入侵率显著降低(P蛋白后,荧光微球可成功进入EBL细胞。【结论】MBOVPG45_0564基因编码的LRR5蛋白定位在M.bovis膜上,在M.bovis入侵宿主细胞过程中发挥着重要作用。

关键词：牛支原体 MBOVPG45_0564基因入侵蛋白表达生物学功能

微囊藻毒素对凡纳滨对虾肝胰腺组织蛋白表达的影响

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应用生态学报 2023年第8期34卷 2259-2266页

作者：林津圭张达娟贾滢暄汪艳昭张树林毕相东天津农学院水产学院天津300392 天津市水产生态及养殖重点实验室天津300392

在淡水池塘集约化养殖中,蓝藻水华爆发产生的微囊藻毒素(MC-LR)是制约南美白对虾养殖业健康可持续发展的瓶颈之一。本研究在分析MC-LR胁迫条件下凡纳滨对虾肝胰腺和肌肉中MC-LR含量的基础上,利用DIA高通量蛋白质组学技术探究对虾肝胰腺... 详细信息

在淡水池塘集约化养殖中,蓝藻水华爆发产生的微囊藻毒素(MC-LR)是制约南美白对虾养殖业健康可持续发展的瓶颈之一。本研究在分析MC-LR胁迫条件下凡纳滨对虾肝胰腺和肌肉中MC-LR含量的基础上,利用DIA高通量蛋白质组学技术探究对虾肝胰腺蛋白表达情况。结果表明:注射MC-LR 1 h后,肝胰腺和肌肉中毒素含量达到最高,分别为(6.12±0.45)和(5.00±0.19)μg·kg^(-1),随后逐渐降低,但肝胰腺中毒素含量始终显著高于肌肉;共鉴定820个差异蛋白,其中上调蛋白586个,下调蛋白234个。通过生物信息学分析发现,MC-LR胁迫显著影响溶酶体、RIG-Ⅰ样受体信号和白细胞介素-2等免疫通路;在能量代谢方面主要影响柠檬酸循环、淀粉与蔗糖代谢和戊糖与葡萄糖醛酸转换等,导致碳水化合物代谢紊乱;引起19个与细胞骨架相关的血影蛋白显著上调,破坏对虾肝胰腺细胞骨架。表明MC-LR主要对凡纳滨对虾肝胰腺的免疫、能量代谢和细胞骨架产生影响。

关键词：凡纳滨对虾微囊藻毒素蛋白表达 DIA

马氏珠母贝IGF2BP1基因的鉴定及对矿化相关基因表达的影响

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水产学报 2022年第12期46卷 2265-2273页

作者：熊盼盼张华何毛贤中国科学院南海海洋研究所中国科学院热带海洋生物资源与生态重点实验室广东省应用海洋生物学重点实验室南方海洋科学与工程广东省实验室中国科学院大学

为了研究胰岛素样生长因子2结合蛋白(IGF2BPs)基因是否参与珍珠贝的生物矿化，本实验鉴定了一个马氏珠母贝IGF2BP1基因，命名为PfIGF2BP1-1，该基因cDNA全长为7 348 bp,ORF长1 818 bp，编码605个氨基酸。多序列比对和系统进化分析表明，... 详细信息

为了研究胰岛素样生长因子2结合蛋白(IGF2BPs)基因是否参与珍珠贝的生物矿化，本实验鉴定了一个马氏珠母贝IGF2BP1基因，命名为PfIGF2BP1-1，该基因cDNA全长为7 348 bp,ORF长1 818 bp，编码605个氨基酸。多序列比对和系统进化分析表明，PfIGF2BP1-1有2个RRM结构域和4个KH结构域，与其他物种来源的IGF2BPs同源。实时荧光定量PCR结果显示，PfIGF2BP1-1在马氏珠母贝的8个组织中均有表达，在闭壳肌组织中表达量最高，其次为足和外套膜组织。利用pET-32a原核表达载体构建了含有PfIGF2BP1-1成熟多肽区的重组质粒并成功表达蛋白。在IPTG浓度为0.5 mmol/L,37℃培养8 h的条件下诱导表达PfIGF2BP1-1蛋白最佳。PfIGF2BP1-1蛋白刺激马氏珠母贝外套膜原代细胞，引起壳基质蛋白基因Accbp、MSI7、Nacrein的表达水平显著上升，表明PfIGF2BP1-1蛋白可诱导壳矿化相关基因的表达，参与马氏珠母贝的生物矿化过程。

关键词：马氏珠母贝胰岛素样生长因子2结合蛋白1 蛋白表达壳矿化相关基因

优化酵母浸粉组分提高大肠杆菌BL21 (DE3) 的发酵性能

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食品与发酵工业 2023年

作者：杨坤鹏李世宇杨移志伍业旭覃先武卢争辉安琪酵母股份有限公司湖北大学生物催化与酶工程国家重点实验室

酵母浸粉常被用作微生物培养的氮、维生素和矿物质的来源，是微生物生长与发酵性能的关键影响因素。本研究分析了氨基酸富集型、核苷酸富集型、维生素富集型、微量元素富集型等不同类型酵母浸粉产品对大肠杆菌BL21 (DE3)生长与报告基因... 详细信息

酵母浸粉常被用作微生物培养的氮、维生素和矿物质的来源，是微生物生长与发酵性能的关键影响因素。本研究分析了氨基酸富集型、核苷酸富集型、维生素富集型、微量元素富集型等不同类型酵母浸粉产品对大肠杆菌BL21 (DE3)生长与报告基因绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）表达的影响，结果表明富含RNA和海藻糖的酵母浸粉对重组大肠杆菌BL21 (DE3)-pET28a-gfp细胞生长和GFP表达的综合效果最好。为了进一步优化酵母浸粉组分提高重组大肠杆菌的发酵性能，在富含RNA和海藻糖的酵母浸粉中分别添加氨基酸类、维生素类和糖类成分，发现外源添加维生素E、维生素B6、甲硫氨酸、核黄素、谷氨酸、色氨酸、山梨醇、异亮氨酸等对重组大肠杆菌GFP表达具有促进作用，谷氨酸、天冬氨酸、色氨酸等能提高重组大肠杆菌生物量。对维生素E、谷氨酸、核黄素、维生素C、甲硫氨酸五种添加物进行五因素中心组合设计试验，分别使细胞生长与GFP表达水平提高27%和24%。该研究的结果有助于研制能提高微生物发酵性能的新型酵母浸粉。

关键词：酵母浸粉培养基优化细胞生长蛋白表达