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作者：高渊西南大学

学位级别：硕士

植物转基因技术诞生于20世纪80年代,经历了三十多年的发展历程,在现代农业生产实践中应用非常广泛。它在提高作物产量、改良作物品质、减少杀虫剂和除草剂等农药的使用方面有着非常重要的作用,转基因技术给我们带来了巨大的经济效益。... 详细信息

植物转基因技术诞生于20世纪80年代,经历了三十多年的发展历程,在现代农业生产实践中应用非常广泛。它在提高作物产量、改良作物品质、减少杀虫剂和除草剂等农药的使用方面有着非常重要的作用,转基因技术给我们带来了巨大的经济效益。与此同时,在全球能源危机日趋严重的情况下,转基因技术在生物能源方面的研究和应用日趋突出。可以说,转基因产品已经进入到我们的生活中。可是,人们对转基因产品的生物安全方面的担忧一直没有消除,针对“转基因产品是否安全”这一话题的争论一直在延续。从某种程度上讲,转基因技术的推广和应用因为人们的顾虑和争论而受到了严重的制约。因此,如何让人们既可以享受转基因产品带来的福利而又不担忧转基因产品可能带来的危害,这一问题亟待解决。在转基因生物安全控制方面的研究中,近年来建立的基因删除系统"Gene-deletor"备受关注。该系统在一定程度上能够准确高效的删除外源基因,但是由于其不能用于有性繁殖的植物和杂交作物,大大限制了该系统的推广应用。为了克服上述缺点,本研究对组成删除系统的重要元件—重组酶Cre拆分为N端和C端,构建了一个新的Cre/loxp系统。体外蛋白活性分析和体内实验证明,重组酶Cre蛋白拆分重建后仍具有较高的重组活性,从而为将来进一步改造"Gene-deletor"奠定了基础。论文具体研究结果如下： 1、拆分蛋白体外原核表达及活性检测构建含有拆分后的重组酶Cre-N端(NCre)、C端(CCre)以及含有完整的重组酶Cre的原核表达载体,诱导表达、纯化。蛋白活性检测结果表明,拆分蛋白的N端(即NCre)无重组活性,而C端(即CCre)仍具有活性,进一步将拆分蛋白的N端和C端混合(即NCre+CCre),也表现出重组活性。 2、植物表达载体构建以含有内含子(intron)的重组酶Cre的质粒为模板,用高保真DNA聚合酶进行扩增,获得全长的重组酶Cre以及各拆分片段,构建到中间载体pCXSN上,进一步连接到含有识别位点的载体pCA-LoxP上,筛选获得了预期的植物表达载体,并将上述载体通过冻融法导入发根农杆菌C58C1。 3、Cre蛋白体内重组效应分析采用PCR技术对所有再生发根进行分子检测,确定转化后获得的阳性转基因发根。进一步对PCR检测呈阳性的发根进行GUS组织染色,结果发现,只含有重组酶Cre的单独的拆分片段(NCre或CCre)的转基因发根中,GUS染色为白色,表明单独的Cre拆分蛋白不具有重组活性;而在同时含有NCre和CCre的转基因发根中,GUS染色呈蓝色,说明当NCre和CCre同时存在时可以恢复重组活性,其与含有完整的重组酶Cre的删除结果一致。对删除后的转基因发根进行PCR扩增,测序分析显示,拆分蛋白NCre和CCre重建后确实恢复了重组活性,可有效删除转基因发根中两识别位点loxP之间的所有外源基因。 4、GUS阳性率统计将所有载体转化烟草,对获得转基因发根进行GUS组织染色,统计每个转化载体GUS阳性的发根数目,重复三次,取平均值,用阳性率粗略计算删除效率。染色结果表明,含有完整的重组酶Cre的删除效率为49%,而融合核定位信号后删除效率提高到60%,说明完整的重组酶Cre在烟草发根中具有重组活性;而拆分的重组酶的NCre或者CCre都没有重组活性,但是用同时含有NCre和CCre的双元表达载体转化的烟草发根可以检测到重组酶的活性,删除效率分别为46%和67%,显著提高。

关键词：基因删除重组酶Cre 蛋白拆分生物安全原核表达

基于蛋白拆分技术的Cre/loxP系统在转基因拟南芥杂交后代中的删除效率分析

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基于蛋白拆分技术的Cre/loxP系统在转基因拟南芥杂交后代中的删除...

作者：文梦玲西南大学

学位级别：硕士

转基因技术问世以来发展迅速,广泛应用于农业生产。该技术能够提高农作物产量,改良农产品品质,提升农作物对逆境的抵抗能力,但是,由于外源基因随着花粉的扩散,由此也带来很多生物安全问题。这些生物安全性问题已经引起了公众的广泛关注... 详细信息

转基因技术问世以来发展迅速,广泛应用于农业生产。该技术能够提高农作物产量,改良农产品品质,提升农作物对逆境的抵抗能力,但是,由于外源基因随着花粉的扩散,由此也带来很多生物安全问题。这些生物安全性问题已经引起了公众的广泛关注和担忧,为了解决相关问题,越来越多的生物技术被采用,其中,位点特异性重组酶系统研究得比较广泛。Cre/loxP重组酶系统以其简捷高效,因而广泛应用于动植物中删除转基因作物的外源基因。但是,该系统也存在明显的缺陷,即不能应用于杂交作物。根据前人研究报道,将完整的结构蛋白拆分为互补的两个部分,当拆分片段共表达时,能够实现蛋白结构的重建和恢复结构蛋白的活性。根据前期研究结果,本论文将采用Cre蛋白核苷酸序列第866 bp为拆分位点,采用Intein介导的蛋白拆分技术将Cre重组酶拆分为互补的N端和C端。分别构建两个植物表达载体,之后转化野生型拟南芥进行人工杂交。如果采用花原基特异性启动子控制拆分后重组酶片段的表达,则杂交后,在营养生长阶段外源功能基因仍可保留,到生殖生长阶段重组酶将删除外源基因,使种子和果实不含有外源基因,以期实现由转基因作物生产非转基因产品。此系统为基因删除系统在大田中的推广应用奠定了基础,并最终消除公众对转基因作物生物安全隐患的担忧。主要结果如下:一、内含肽对重组酶Cre拆分后删除活性恢复的影响将Cre蛋白从核苷酸序列第866bp处拆分为N端和C端,以pCA-loxP载体为基础,构建两个植物表达载体。其中一个采用Intein介导的蛋白拆分技术,命名为pNCre-CCre;另外一个载体是将Cre蛋白进行直接拆分,命名为pN-C,将两个载体转化农杆菌C58C1,之后转化烟草。发现pNCre-CCre载体的GUS染色阳性率（31.3%）显著高于pN-C载体的GUS染色阳性率（20.1%）,说明内含肽介导的蛋白拆分可以显著提高拆分后蛋白片段结构重建的效率。二、内含肽介导的Cre蛋白拆分在拟南芥杂交中的删除效率分析将重组酶Cre拆分后的N端与内含肽的N端融合,内含肽C端与重组酶C端融合,以载体pCA-loxP为基础,分别构建两个植物表达载体,命名为pCA-NCre-In和pCA-Ic-CCre。将载体转化野生型拟南芥,筛选单拷贝纯合体进行人工杂交,通过对杂交子代GUS染色和测定GUS酶活,我们发现,拆分系统运用于拟南芥杂交中,可以高效地删除外源基因,效率最高达到96.736%。三、建立能彻底删除所有外源基因的基因删除系统改良植物表达载体的构建,将所有外源基因构建在两个同向loxP位点之间,两个loxP位点两侧即是T-DNA的左边界和右边界。将构建的两个植物表达载体分别转化野生型拟南芥,筛选单拷贝纯合体,之后进行人工杂交。通过对报告基因GUS和GFP的检测,以及杂交子代中目的基因的扩增,我们发现在杂交子代拟南芥中,虽然多数情况是部分删除,即并不是每一个植物细胞都发生了删除,而是部分细胞或者部分组织发生了完全删除,但单独的N端和C端的完全删除是存在的。因此,该研究为基因删除系统在大田中的应用奠定了基础。

关键词：生物安全 Cre/loxP 基因删除蛋白拆分蛋白内含肽

内含肽介导的重组酶Cre拆分及其在拟南芥中的删除活性研究

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内含肽介导的重组酶Cre拆分及其在拟南芥中的删除活性研究

作者：付夏楠西南大学

学位级别：硕士

近年来,植物转基因技术的研究和开发取得了巨大进展,但同时也存在一些不容忽视的问题,其中对转基因作物的安全性评价问题更是成为国际社会广泛关注的焦点。转基因技术可能带来的生物安全性问题,俨然已经成为将转基因作物推广应用的主要... 详细信息

近年来,植物转基因技术的研究和开发取得了巨大进展,但同时也存在一些不容忽视的问题,其中对转基因作物的安全性评价问题更是成为国际社会广泛关注的焦点。转基因技术可能带来的生物安全性问题,俨然已经成为将转基因作物推广应用的主要障碍,一些生物技术手段己先后应用于转基因作物生物安全隐患控制当中,其中能高效并彻底地删除转基因植物中外源基因的基因删除系统"Gene-deletor",为转基因作物生物安全隐患问题的解决提供了一个重要思路,但是该系统却不能应用于杂交作物育种中。为获得一个可用于杂交作物的高效基因删除系统,本研究对"Gene-deletor"系统进行改良,通过该系统所依赖的位点特异性重组酶Cre进行拆分,即将有重组活性的Cre蛋白拆分为没有活性的N端和C端多肽片段,然后把这两段无活性的多肽片段分别置于亲本中,通过人工杂交技术,使得杂交子代中同时含有重组酶Cre的两段多肽,而拆分后的Cre蛋白的N端和C端在蛋白内含肽Intein的介导下恢复了重组酶Cre的部分活性,为建立起一个可用于杂交作物育种的基因删除系统,实现生产安全转基因产品的目标奠定基础。主要结果如下：一、拆分位点的选择。通过对重组蛋白Cre高级结构的分析,结合前人的研究工作,共选择了五个拆分位点,分别为第384bp、629bp、740bp、866bp和1013bp,即从Cre蛋白氨基酸序列的第128、153、190、232和281位点处将其拆分,其中第384bp位点处于Cre蛋白的结构域里,其余4个位点则处于Cre蛋白结构域之间的连接区域。二、不同拆分位点删除效率的比较。以植物表达载体pCAMBIA1305.1为基本骨架,在已构建的载体pCA-Loxp的基础上,将相应目的片段连接上,得到五个拆分载体,即pCA-CRE384、pCA-CRE629、pCA-CRE740、pCA-CRE866、 pCA-CRE1013。通过发根农杆菌C58C1转化模式植物烟草,初步检验拆分蛋白的重组活性,并统计了5个载体的删除效率,结果发现,Cre384这个作为阴性对照的拆分载体不能使烟草发根染为蓝色,而Cre629、Cre740、Cre866、Cre1013这四个位点的拆分载体,均能使毛状根染成蓝色,GUS染色阳性率分别为20%、18.5%、31.3%、30.8%。三、拆分系统在拟南芥中的删除活性分析。根据五个拆分位点载体烟草发根的删除效率研究,进一步选择Cre866作为最佳拆分位点,通过根癌农杆菌EHA105转化拟南芥,经T2代筛选后,共获得6株拟南芥单拷贝转基因植株,进行GUS染色分析,并分别提取不同转基因株系的GUS蛋白,用荧光分光光度计法定量测定了叶片中GUS蛋白的表达活性,结果发现,不同转基因株系拟南芥GUS染色蓝色程度各有差异,随着蓝色程度的加深,GUS蛋白的活性越高。四、杂交方法验证拆分系统的删除活性。将内含肽介导的分别含Cre蛋白N端和C端的杂交系统载体转化拟南芥,经T3代自交筛选获得转基因拟南芥单拷贝纯合体,将其作为亲本进行人工杂交,获得杂交子代,通过GUS染色发现,只单独含有Cre蛋白N端和C端的亲本拟南芥均不能被染成蓝色,而杂交子代则全部被染为不同程度的蓝色,说明在蛋白内含肽intein的介导下,Cre蛋白恢复了部分重组活性并发生了删除作用。

关键词：重组酶Cre 基因删除蛋白拆分蛋白内含肽生物安全

位点特异性重组酶FLP的拆分、重建及其在烟草中的重组活性分析

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位点特异性重组酶FLP的拆分、重建及其在烟草中的重组活性分析

作者：高江林西南大学

学位级别：硕士

转基因技术自问世以来发展迅速,已广泛应用于现代农业生产中。该技术可有效地改良作物品质,提高作物产量,减少除草剂、杀虫剂等农药的使用量,已经给我们带来了巨大的经济利益。同时,转基因技术在解决全球性的能源危机、生物医学和保障... 详细信息

转基因技术自问世以来发展迅速,已广泛应用于现代农业生产中。该技术可有效地改良作物品质,提高作物产量,减少除草剂、杀虫剂等农药的使用量,已经给我们带来了巨大的经济利益。同时,转基因技术在解决全球性的能源危机、生物医学和保障农业的可持续发展等方面也扮演着越来越重要的作用。然而,公众一直对转基因技术推广应用所带来的潜在生物安全性心存担忧,人类对转基因技术的利弊争论从未停止过,这些争论和担忧已严重制约着转基因技术的进一步推广应用,因此,如何让人类在享受转基因技术成果的同时又无须担心其潜在的生物安全隐患,已经成为当前亟待解决的重大问题。前人的研究表明,基因删除系统"Gene-deletor"可有效消除转基因植物中所有的外源基因,但该技术仍不能应用于杂交作物育种。为了将基因删除系统应用于大田生产中解决转基因安全问题,本实论文对基因删除系统"Gene-deletor"进行了进一步改进,将重组酶FLP进行了拆分,构建了一个可拆分的基因删除系统,通过转化模式植物—烟草,验证了该系统拆分并重建后仍具有高效的重组活性。论文具体结果如下：一、植物表达载体的构建以含有植物性内含子Stlfl的重组酶FLP编码序列为模板,采用高保真酶进行PCR扩增,获得重组酶FLP各拆分片段及全长片段,回收测序验证后连接至中间载体pCXSN上,而后通过中间载体FRT-NOS-FRT-pUC19获得识别位点FRT,最后以pCambia1305.1为骨架,筛选正义重组质粒,构建了一整套基因拆分系统植物表达载体,共计12个。并将上述载体通过冻融法导入发根农杆菌C58C1和根癌农杆菌EHA105中。二、转基因毛状根GUS染色分析通过叶盘法转化模式植物烟草,获得转基因毛状根若干。GUS染色结果显示,当转化未拆分的重组酶FLP全长编码序列时,可检测到GUS活性,表明FLP/FRT系统可以在转基因发根中起作用。当重组酶FLP拆分为N端和C端片段后,基因删除系统中含有单独的FLP酶N端或C端时未检测到GUS活性,表明该蛋白片断无重组活性;而当删除系统中同时含有拆分后的重组酶N端和C端编码序列,GUS染色发现,转基因毛状根呈蓝色,表明拆分重建后重组酶活性可以得到部分恢复。三、转基因毛状根中的分子验证根据植物表达载体上T-DNA区间序列,设计两对特异性检测引物,用于转基因材料的分子检测外源基因。PCR结果显示所有载体的T-DNA区间均已成功导入到烟草的基因组中。提取含有不同FLP重组酶基因片段的转基因毛状根DNA作为PCR模版,在识别位点FRT两端的载体序列设计引物,进行PCR扩增,凝胶电泳检测发现,当所有GUS染色呈阳性的转基因毛状根中,均可获得一条377 bp的扩增条带,表明FRT识别位点间的所有基因均被删除;而在未发生删除前,采用该引物,则扩增获得不同大小的扩增条带(目的片段+载体序列)。PCR产物测序结果进一步说明,在GUS阳性转基因株系中外源基因被准确删除,仅有一个识别序列FRT残留。四、拆分系统删除效率分析通过对毛状根GUS染色,统计拆分后重组酶系统的删除效率。选取转化后烟草叶盘上独立的30-50个毛状根进行GUS染色,统计GUS阳性毛状根所占的比例。对每个转化载体获得的毛状根重复统计三次,获得平均值。结果显示,转化完整的重组酶FLP时,它可在毛状根中行使重组活性,删除效率达到37.8%,而存在核定位信号时提高至43.5%;当重组酶FLP被拆分为N端和C端后,其单独存在时均无重组活性,而将拆分片段构建为双元表达载体后同时整合至烟草基因组上,重组酶活性得到恢复,其删除效率达到29.4%,与前人的研究结果相近。而在FLP酶N端和／或C端分别引入核定位信号后,可显著促进重组酶活性的恢复,其删除效率分别达到57.1%,63.6%和75%。

关键词：基因删除重组酶FLP 蛋白拆分核定位信号生物安全