基于蛋白拆分的Cre/loxp系统构建及其在烟草发根中删除活性的初步验证

作     者：高渊 

作者单位：西南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：罗克明

授予年度：2013年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：基因删除 重组酶Cre 蛋白拆分 生物安全 原核表达 

摘      要：植物转基因技术诞生于20世纪80年代,经历了三十多年的发展历程,在现代农业生产实践中应用非常广泛。它在提高作物产量、改良作物品质、减少杀虫剂和除草剂等农药的使用方面有着非常重要的作用,转基因技术给我们带来了巨大的经济效益。与此同时,在全球能源危机日趋严重的情况下,转基因技术在生物能源方面的研究和应用日趋突出。可以说,转基因产品已经进入到我们的生活中。可是,人们对转基因产品的生物安全方面的担忧一直没有消除,针对“转基因产品是否安全这一话题的争论一直在延续。从某种程度上讲,转基因技术的推广和应用因为人们的顾虑和争论而受到了严重的制约。因此,如何让人们既可以享受转基因产品带来的福利而又不担忧转基因产品可能带来的危害,这一问题亟待解决。 在转基因生物安全控制方面的研究中,近年来建立的基因删除系统Gene-deletor备受关注。该系统在一定程度上能够准确高效的删除外源基因,但是由于其不能用于有性繁殖的植物和杂交作物,大大限制了该系统的推广应用。为了克服上述缺点,本研究对组成删除系统的重要元件—重组酶Cre拆分为N端和C端,构建了一个新的Cre/loxp系统。体外蛋白活性分析和体内实验证明,重组酶Cre蛋白拆分重建后仍具有较高的重组活性,从而为将来进一步改造Gene-deletor奠定了基础。论文具体研究结果如下： 1、拆分蛋白体外原核表达及活性检测 构建含有拆分后的重组酶Cre-N端(NCre)、C端(CCre)以及含有完整的重组酶Cre的原核表达载体,诱导表达、纯化。蛋白活性检测结果表明,拆分蛋白的N端(即NCre)无重组活性,而C端(即CCre)仍具有活性,进一步将拆分蛋白的N端和C端混合(即NCre+CCre),也表现出重组活性。 2、植物表达载体构建以含有内含子(intron)的重组酶Cre的质粒为模板,用高保真DNA聚合酶进行扩增,获得全长的重组酶Cre以及各拆分片段,构建到中间载体pCXSN上,进一步连接到含有识别位点的载体pCA-LoxP上,筛选获得了预期的植物表达载体,并将上述载体通过冻融法导入发根农杆菌C58C1。 3、Cre蛋白体内重组效应分析 采用PCR技术对所有再生发根进行分子检测,确定转化后获得的阳性转基因发根。进一步对PCR检测呈阳性的发根进行GUS组织染色,结果发现,只含有重组酶Cre的单独的拆分片段(NCre或CCre)的转基因发根中,GUS染色为白色,表明单独的Cre拆分蛋白不具有重组活性;而在同时含有NCre和CCre的转基因发根中,GUS染色呈蓝色,说明当NCre和CCre同时存在时可以恢复重组活性,其与含有完整的重组酶Cre的删除结果一致。对删除后的转基因发根进行PCR扩增,测序分析显示,拆分蛋白NCre和CCre重建后确实恢复了重组活性,可有效删除转基因发根中两识别位点loxP之间的所有外源基因。 4、GUS阳性率统计 将所有载体转化烟草,对获得转基因发根进行GUS组织染色,统计每个转化载体GUS阳性的发根数目,重复三次,取平均值,用阳性率粗略计算删除效率。染色结果表明,含有完整的重组酶Cre的删除效率为49%,而融合核定位信号后删除效率提高到60%,说明完整的重组酶Cre在烟草发根中具有重组活性;而拆分的重组酶的NCre或者CCre都没有重组活性,但是用同时含有NCre和CCre的双元表达载体转化的烟草发根可以检测到重组酶的活性,删除效率分别为46%和67%,显著提高。