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北京某绿地蚊媒病毒的分离和鉴定

中国兽医杂志 2024年第1期60卷 52-58页

作者：李金鑫廖佳玮张越任行任志浩施霁桢毕玉海谭丽琼苏敬良中国农业大学动物医学院兽医公共卫生安全全国重点实验室北京海淀100193 北京市海淀区圆明园管理处北京海淀100084 中国科学院微生物研究所病原微生物与免疫学重点实验室北京海淀100101

为了解北京某绿地蚊媒病毒的分布情况,本试验使用诱蚊灯捕蚊采集到蚊虫标本19000余只,利用蚊子细胞C6/36培养进行病毒分离,利用高通量测序和逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)鉴定分离株;RT-PCR测定分离株病毒的序列,并与国内外相应病毒序... 详细信息

为了解北京某绿地蚊媒病毒的分布情况,本试验使用诱蚊灯捕蚊采集到蚊虫标本19000余只,利用蚊子细胞C6/36培养进行病毒分离,利用高通量测序和逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)鉴定分离株;RT-PCR测定分离株病毒的序列,并与国内外相应病毒序列进行比对分析。结果显示,样本经病毒分离获得2株可引起明显细胞病变的分离株,分别命名为BJ2021/01和BJ2021/02。高通量测序和RT-PCR检测结果显示,BJ2021/01分离株含有版纳病毒(BAV)、忍者病毒(SHTV)、沙捞越病毒(SWKV)和库蚊源类芜菁黄花叶病毒科病毒(CuTLV),为4种病毒的混合物;BJ2021/02为BAV。基因序列分析结果显示,BAV分离株BJ2021/02的12个片段与国内外BAV分离株的核苷酸同源性为58.1%~98.7%,编码氨基酸的同源性为54.4%~98.9%。系统进化分析结果显示,BJ2021/02分离株属基因A型。本试验结果丰富了我国BAV的基因组序列,为开展北京市BAV的流行病学研究提供了参考,为虫媒病毒病的预防和控制提供了病原学依据。

关键词：蚊媒病毒版纳病毒忍者病毒沙捞越病毒库蚊源类芜菁黄花叶病毒科病毒

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蚊媒病毒传播和感染的研究进展

Science Bulletin 2023年第23期68卷 2884-2888页

作者：朱毅斌刘建英程功 Tsinghua University-Peking University Joint Center for Life Sciences School of MedicineTsinghua UniversityBeijing 100084China Institute of Infectious Diseases Shenzhen Bay LaboratoryShenzhen 518000China Institute of Pathogenic Organisms Shenzhen Center for Disease Control and PreventionShenzhen 518055China

Arboviruses,a diverse group of vector-borne pathogens transmitted by various vectors such as mosquitoes,ticks,and flies,encompass members of the Flaviviridae,Togaviridae,Phenuviridae,Peribunyaviridae,Reoviridae,Asfarv... 详细信息

关键词：蚊媒病毒 diverse flies

3种蚊媒病毒快速荧光PCR检测方法与性能评价

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病毒学报 2023年第3期39卷 743-751页

作者：徐聪灵王静杨绪理陈峰刘文干耿合员连云港海关连云港222042 南通海关南通226005 安徽安龙基因科技有限公司合肥230000 江苏国际旅行卫生保健中心(南京海关口岸门诊部) 南京210019

建立寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)、登革病毒(Dengue virus,DENV)和黄热病毒(Yellow fever virus,YFV)3种蚊媒传染病核酸快速实时荧光定量检测方法。以寨卡病毒polyprotein gene基因,登革病毒NS5基因,黄热病毒3’UTR基因作为靶区域设计相... 详细信息

建立寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)、登革病毒(Dengue virus,DENV)和黄热病毒(Yellow fever virus,YFV)3种蚊媒传染病核酸快速实时荧光定量检测方法。以寨卡病毒polyprotein gene基因,登革病毒NS5基因,黄热病毒3’UTR基因作为靶区域设计相应的引物探针,探针的5’端分别标记不同的荧光基团,3’端标记相应的淬灭基团,对扩增体系中引物探针浓度、热启动Taq酶浓度、逆转录酶浓度、RNA酶抑制剂浓度分别进行优化。构建了一种可同时用于寨卡病毒、登革病毒和黄热病毒三重快速荧光PCR检测体系,25μL扩增体系中ZIKV、DENV和YFV的引物浓度分别为200 nmol/L、240 nmol/L和240 nmol/L;探针浓度分别为200 nmol/L、240 nmol/L和80 nmol/L;热启动Taq酶、逆转录酶和RNA酶抑制剂的终浓度为分别为2.5U/反应、60U/反应和80U/反应。该检测体系对3种病原体的最低检测限均为1.0×10^(3)拷贝/mL,在MIC IAT C2-48和ABI7500两种不同型号的实时荧光定量PCR仪上检测结果一致,对登革热、寨卡和黄热病毒血清样本检测均为阳性扩增,与丙型肝炎病毒、乙型脑炎病毒、副流感病毒、腺病毒等无交叉反应。因此,本研究建立的寨卡病毒、登革病毒和黄热病毒的三重快速荧光PCR检测体系可用于对上述3种病毒的定性或定量检测。

关键词：快速荧光PCR检测蚊媒病毒

多重重组酶聚合酶等温扩增技术快速联检四种常见蚊媒病毒的实验研究

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多重重组酶聚合酶等温扩增技术快速联检四种常见蚊媒病毒的实验研...

作者：韩明月浙江中医药大学

学位级别：硕士

目的在重组酶聚合酶等温扩增技术（Recombinase Polymerase Amplification,RPA）的基础上,建立单重及四重逆转录重组酶聚合酶等温扩增方法（Reverse Transcription-Recombinase Polymerase Amplification,RT-RPA）,在单个反应中对登革热病毒（Dengue virus,DENV）、黄热病毒（Yellow fever virus,YFV）、基孔肯雅热病毒（Chikungunyavirus,CHIKV）、寨卡病毒（Zikavirus,ZIKV）的感染进行快速诊断及鉴别诊断。方法①通过特异性引物和探针的设计及筛选,建立单重RT-RPA体系用以分别检测DENY、YFV、CHIKV、ZIKV质粒标准品,并对其特异性、灵敏度和重复性进行评价。②在单重RT-RPA体系的基础上,利用正交设计对不同反应组分进行优化筛选,建立四重RT-RPA体系用以同时检测DENV、YFV、CHIKV、ZIKV质粒标准品,并对其特异性、灵敏度和重复性进行评价。③采用体外合成RNA样本以及临床血清样本对建立的单重RT-RPA及四重RT-RPA反应体系及其特异性、灵敏度和重复性进行验证。同时比较RT-PCR、单重RT-RPA、四重RT-RPA方法阳性标本检出率的差异。结果①单重RT-RPA及四重RT-RPA反应体系均可检出DENV、YFV、CHIKV、ZIKV的质粒标准品、体外合成RNA样本以及临床样本。②单重及四重RT-RPA反应体系与常见病原体无交叉反应,单重RT-RPA对DENV、ZIKV、CHIKV、ZIKV质粒标准品的检出限分别为 1× 102 copies/ml、1 × 1 02 copies/ml、1 × 1 02 copies/ml、＜1 × 1 02 copies/ml,四重RT-RPA对经注射用水稀释的DENV、CHIKV、YFV、ZIKV体外合成RNA的检出限分别为 5× 102copies/ml、5×102copies/ml、5×102copies/ml、5×103copies/ml,对经正常人血清稀释的DENV、CHIKV、YFV、ZIKV的体外合成RNA的检出限分别为5×103copies/ml、5×103copies/ml、5×103copies/ml、5×103copies/ml。③单重 RT-RPA 及四重RT-RPA法与RT-PCR法阳性标本检出率差异无统计学意义（P=0.972）。结论本研究建立的单重及四重RT-RPA检测方法可用于对DENV、CHIKV、YFV、ZIKV质粒标准品、体外合成RNA以及临床样本的检测,且特异性好、灵敏度高、重复性好,对标本的检出率与RT-PCR法无明显差异。对蚊媒传染病的早期诊断及鉴别诊断具有很重要的意义,同时也可为其他新发再发传染病的快速诊断方法建立提供研究方向。

关键词：重组酶聚合酶等温扩增技术蚊媒病毒登革热病毒黄热病毒基孔肯雅热病毒寨卡病毒

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中国蚊和蚊媒病毒的空间分布及预测研究

中国蚊和蚊媒病毒的空间分布及预测研究

作者：王涛军事科学院

学位级别：硕士

背景:蚊是危害最严重的媒介生物之一,全球范围内共报道3 500多种蚊,其中300多种在我国被发现和鉴定,约占全部蚊种的十分之一。蚊能携带和传播的病原体种类较多,并导致多种危害严重的蚊媒传染病,如疟疾、流行性乙型脑炎、登革热、基孔肯... 详细信息

背景:蚊是危害最严重的媒介生物之一,全球范围内共报道3 500多种蚊,其中300多种在我国被发现和鉴定,约占全部蚊种的十分之一。蚊能携带和传播的病原体种类较多,并导致多种危害严重的蚊媒传染病,如疟疾、流行性乙型脑炎、登革热、基孔肯雅热和寨卡病毒病等。据WHO估计,全球每年新发疟疾病例2.12亿,流行性乙型脑炎病例6.8万,登革热病例9 600万,基孔肯雅热病例69.3万,寨卡病毒病病例50万,疾病负担和危害极为严重。在中国,4种蚊媒传染病被纳入法定报告传染病目录,其中丝虫病和疟疾已被WHO认证消除,但流行性乙型脑炎和登革热疫情仍时有发生,给人民健康造成较大危害。此外,蚊虫携带和传播的蚊媒病毒多为单链RNA病毒,与双链DNA病毒相比,单链RNA病毒更容易发生变异,这使得病毒的蚊虫媒介和传播范围容易发生改变。典型的例子是,2005年以前基孔肯雅病毒主要在非洲地区流行,此后由于变异导致基孔肯雅病毒能通过白纹伊蚊感染、复制和传播,此后基孔肯雅病毒在其他大洲开始传播和流行。我国地域辽阔,物种丰富,不同地区生境特征和动物种群的分布格局差异较大,加之越发频繁的人口流动和动物贸易、快速的城市化和全球化、境外病例不断输入等因素使得优势蚊种、丰度及其携带的蚊媒病毒的分布范围发生了改变,加大了蚊虫和蚊媒病毒的防制难度。当前尚缺乏全国范围内优势蚊种和蚊媒病毒的生态位和潜在分布区域的预测研究。目的:系统收集中国蚊和蚊媒病毒调查的文献记录,经过数据的录入、核对和清洗,提取文献和调查报告中的调查地点、调查时间、调查方法、蚊和蚊媒病毒的种属、检出率、病毒分型等信息,建立规范统一的蚊种和蚊媒病毒的空间分布数据库;采用地理信息分析软件,绘制蚊和蚊媒病毒的空间分布地图,明确其空间分布特征;通过汇总蚊媒病毒与携带蚊种和感染动物宿主信息,构建分布矩阵图,明确不同蚊媒病毒在蚊和动物中的携带/感染特征;基于中国各地域气候生态、地理环境、社会经济和生物学因素数据,建立机器学习模型预测主要蚊种的潜在分布范围,明确影响其分布的决定因素;以重要蚊媒传染病登革热和流行性乙型脑炎为例,将模型预测的媒介蚊种的潜在分布概率结合其他生境因素纳入两阶段Xg Boost（Extreme gradient boosting）模型,预测重要蚊媒传染病的风险区域分布和相关的危险因素。方法:1本研究从文献数据库,包括知网、万方、维普、Pub Med和Web of Science数据库,以及Gen Bank数据库中收集1954～2020年中国大陆的蚊和蚊媒病毒的空间分布信息的记录,提取记录中的调查地点、调查时间、调查方法、蚊和蚊媒病毒的种属、检出率、病毒分型等关键信息,经过数据的录入、核对和清洗,建立格式规范统一的蚊和蚊媒病毒的标准化数据库。运用R语言和Arc GIS软件将数据库中的调查地点的省市县级行政区划与中国行政区划地图进行空间连接,结合中国动物地理区划地图,绘制我国蚊种和蚊媒病毒的空间分布地图,分析蚊种和蚊媒病毒的空间分布特征。2在全国区县尺度上收集与蚊分布密切相关的53种变量:温度、降雨量、土地利用类型、地形、家畜家禽密度、人口密度及哺乳动物丰富度等。通过减少纳入变量个数和交叉验证的方式避免过拟合,采用较小的学习率和较大的树复杂度来避免欠拟合,建立稳健的BRT模型。通过逻辑回归算法（Logistic regression）,以气象等环境变量作为预测因子,预测每个县进行蚊种调查的概率,采用此概率进行逆概率加权,作为BRT模型的权重,来平衡潜在的报告偏倚。建立26个主要蚊种的BRT模型,包括13种库蚊、8种按蚊、4种伊蚊和1种阿蚊,模型输出结果包括蚊种的预测风险分布、影响因素的贡献度及反应曲线。通过加权平均聚类分析,将26个主要蚊种的3组指标作为聚类分析的依据:BRT模型的相对贡献度、预测蚊种存在的区县与所有区县的差异及蚊种预测概率与自变量的相关系数。通过聚类分析将26个主要蚊种分为7个大类,对7个大类的空间分布和变量特征进行归纳分析。3对登革热和流行性乙型脑炎的病例数据进行汇总,计算我国区县尺度的登革热和流行性乙型脑炎的发病率,结合文献报道的蚊、宿主动物中病毒的位置信息,通过建立两阶段Xg Boost模型,分析登革热和流行性乙型脑炎的发病率与气候生态、环境、社会经济和生物因素的关系。第一阶段采用Logistic分布,将无病例报道且无病原体检出的区县作为阴性区县,将发病率大于零或存在病原体检出的区县作为阳性区县,建立二分类Xg Boost模型,预测病毒可能存在的分布范围;第二阶段采用Gamma分布,将2014～2018年的发病率作为因变量建立Xg Boost模型,预测各地区的发病率大小。最终模型的预测发病率由第一阶段预测值和第二阶段预测值通过计算得到:首先根据第一阶段的预测概率判断是否存在病毒,如

关键词：蚊蚊媒病毒机器学习模型危险因素空间分布

一种蚊媒病毒液相芯片检测方法的评价及应用研究

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中国口岸科学技术 2022年第7期4卷 66-71页

作者：周有良胡春凌潘丽陈夫志孙玉莲葛斌鹏苏州海关苏州215011 深圳正昇生物科技有限公司深圳518050 苏州市姑苏区民政和卫生健康局苏州215000

本文对所建立的蚊媒病毒液相芯片检测方法的特异性进行研究,并采用该方法对50例发热病人核酸样本进行检测,同时与商业化荧光PCR检测试剂盒检测结果进行比较。结果表明,所建立的蚊媒病毒液相芯片检测方法的特异性较好,没有出现不同病毒... 详细信息

本文对所建立的蚊媒病毒液相芯片检测方法的特异性进行研究,并采用该方法对50例发热病人核酸样本进行检测,同时与商业化荧光PCR检测试剂盒检测结果进行比较。结果表明,所建立的蚊媒病毒液相芯片检测方法的特异性较好,没有出现不同病毒之间检测结果相互干扰的现象;50例发热病人核酸样本检出阳性11例,其中,流行性乙型脑炎病毒(JEV)阳性3例、登革热病毒(DENV)阳性6例、基孔肯雅热病毒(CHIKV)阳性2例,检测结果与商业化荧光PCR检测试剂盒检测结果一致。蚊媒病毒液相芯片检测方法可用于临床标本蚊媒病毒的筛查检测。

关键词：蚊媒病毒液相芯片检测

双重荧光RT-RAA检测5种蚊媒病毒方法的建立

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中国国境卫生检疫杂志 2022年第5期45卷 337-341页

作者：周冬根许恒毅罗洁胡群宁波国际旅行卫生保健中心浙江宁波315012 南昌大学食品科学与技术国家重点实验室

目的建立快速筛查登革病毒(DENV)、乙型脑炎病毒(JEV)、寨卡病毒(ZIKV)、黄热病毒(YFV)以及基孔肯雅病毒(CHIKV)5种蚊媒病毒的重组酶介导等温扩增(RAA)方法。方法分析上述5种病毒的保守基因作为靶标区域并引入人核糖核酸酶P(RNaseP)基... 详细信息

目的建立快速筛查登革病毒(DENV)、乙型脑炎病毒(JEV)、寨卡病毒(ZIKV)、黄热病毒(YFV)以及基孔肯雅病毒(CHIKV)5种蚊媒病毒的重组酶介导等温扩增(RAA)方法。方法分析上述5种病毒的保守基因作为靶标区域并引入人核糖核酸酶P(RNaseP)基因作为内对照,设计6组特异性引物和探针,并根据引物二聚体和错配等生物信息学分析将6组引物和探针组合成3组双重荧光RT-RAA检测体系,在相同反应条件下进行检测。用5种病毒的体外转录RNA验证3组荧光RT-RAA检测体系的灵敏度,用疟原虫、汉坦病毒、汉城病毒以及流感病毒核酸验证方法的特异性;分别用中浓度(10^(4)拷贝/μl)、低浓度(10^(2)拷贝/μl)5种病毒的体外转录RNA验证3组双重荧光RT-RAA检测体系的重复性。结果通过生物信息学分析,将5种病毒和RNaseP组合为3组双重荧光RT-RAA检测体系,分别为DENV与ZIKV、JEV与YFV以及CHIKV与RNaseP,均在39℃反应15 min。3组双重荧光RT-RAA检测体系检测5种病毒体外转录RNA的灵敏度介于1~10^(2)拷贝/μl,其中检测DENV、ZIKV和YFV的灵敏度均为1拷贝/μl,JEV灵敏度为10拷贝/μl,CHIKV灵敏度为10^(2)拷贝/μl;3组荧光RT-RAA检测体系均与其他病毒无交叉反应。5种病毒的中浓度体外转录RNA的检出率均达到100.0%,低浓度体外转录RNA也能达到83.3%。结论本研究建立的检测方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,可用于人体及蚊类样本中5种蚊媒病毒的筛查。

关键词：重组酶介导等温扩增蚊媒病毒双重检测登革病毒乙型脑炎病毒寨卡病毒黄热病毒基孔肯雅病毒

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3种蚊媒病毒荧光PCR检测方法的建立

中国口岸科学技术 2023年第12期5卷 92-96页

作者：王红李晓宾李君萍王文娟郭红丽杨玉山西国际旅行卫生保健中心(太原海关口岸门诊部) 太原030021

本研究拟建立一种多重荧光PCR检测技术,可同时检测登革病毒(Dengue virus,DENV)、寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)和西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)。通过设计上述3种病原体的特异性引物,优化荧光PCR反应体系和扩增条件,再对多重荧光PCR反... 详细信息

本研究拟建立一种多重荧光PCR检测技术,可同时检测登革病毒(Dengue virus,DENV)、寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)和西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)。通过设计上述3种病原体的特异性引物,优化荧光PCR反应体系和扩增条件,再对多重荧光PCR反应体系的特异性、灵敏度和重复性进行验证。实验结果显示,建立的多重荧光PCR方法的引物和探针终浓度分别为600 nmol/L和400 nmol/L,退火温度为60℃;其最低检测限浓度为1.0×10^(3)拷贝/mL,具有较好的特异性和重复性,病原体之间无交叉反应。本研究所建立的多重荧光PCR检测方法可用于登革病毒、寨卡病毒和西尼罗病毒的定性检测,为蚊媒传染病的检测提供重要技术支持。

关键词：蚊媒病毒登革病毒寨卡病毒西尼罗病毒

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山西省运城市2012年蚊媒病毒的分离鉴定

中华流行病学杂志 2015年第4期36卷 368-373页

作者：郑雅匀曹玉玺付士红程璟侠赵俊英代培芳孔祥盛梁国栋中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所传染病预防控制国家重点实验室北京100052 山西省疾病预防控制中心

目的了解山西省运城市蚊虫及蚊媒病毒的种类和分布。方法2012年8月在山西省运城市临猗县和永济市采集蚊虫标本，经鉴定分类和分批研磨后，利用细胞（C6／36和BHK21）培养方法分离病毒，对阳性分离物使用蚊媒病毒种属特异引物进行RT-PCR... 详细信息

目的了解山西省运城市蚊虫及蚊媒病毒的种类和分布。方法2012年8月在山西省运城市临猗县和永济市采集蚊虫标本，经鉴定分类和分批研磨后，利用细胞（C6／36和BHK21）培养方法分离病毒，对阳性分离物使用蚊媒病毒种属特异引物进行RT-PCR扩增鉴定。结果采集4属7种10455只蚊虫，临猗县和永济市优势蚊种分别为淡色库蚊（91．96％）和三带喙库蚊（72．85％）。经鉴定分析，从标本中分离到15株基因I型乙型脑炎病毒（JEV）、4株库蚊黄病毒（CxFV）、3株淡色库蚊浓核病毒（CppDNV）和1株盖塔病毒（GETV）。结论首次从山西省分离GETV和CxFV；三带喙库蚊仍是运城市优势蚊种，目前当地自然循环的JEV仍以基因I型为主。

关键词：蚊媒病毒乙型脑炎病毒盖塔病毒库蚊黄病毒