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虎眼万年青总皂苷诱导肝癌HepG-2细胞凋亡的机制研究

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中药材 2016年第4期39卷 867-871页

作者：曲中原石鑫邹翔季宇彬哈尔滨商业大学药学院黑龙江哈尔滨150076 哈尔滨商业大学药物研究所博士后科研工作站黑龙江哈尔滨150076 哈尔滨商业大学国家教育部抗肿瘤天然药物工程研究中心黑龙江哈尔滨150076

目的:探讨虎眼万年青总皂苷诱导人肝癌HepG-2细胞凋亡的机制。方法:MTT法检测虎眼万年青总皂苷对HepG-2细胞增殖的影响;倒置显微镜观察细胞形态;流式细胞仪测定细胞凋亡率、细胞线粒体膜电位和Cyt-C蛋白表达水平;透射电镜观察细胞超微... 详细信息

目的:探讨虎眼万年青总皂苷诱导人肝癌HepG-2细胞凋亡的机制。方法:MTT法检测虎眼万年青总皂苷对HepG-2细胞增殖的影响;倒置显微镜观察细胞形态;流式细胞仪测定细胞凋亡率、细胞线粒体膜电位和Cyt-C蛋白表达水平;透射电镜观察细胞超微结构的改变;酶标仪检测细胞内Caspase-3活性。结果:虎眼万年青总皂苷对HepG-2细胞增殖有抑制作用,IC_(50)为(79.80±0.18)μg/m L;虎眼万年青总皂苷作用细胞后,倒置显微镜下可见细胞变圆,折光性减弱,悬浮细胞增多;透射电镜下可见细胞出现典型的凋亡特征;随着虎眼万年青总皂苷浓度的增加,细胞凋亡率、细胞内Cyt-C表达水平及Caspase-3的活性均显著升高,细胞线粒体膜电位显著降低(P虎眼万年青总皂苷可显著抑制人肝癌HepG-2细胞的增殖,并可通过启动线粒体途径诱导HepG-2细胞发生凋亡。

关键词：虎眼万年青总皂苷人肝癌Hep G-2细胞凋亡机制

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虎眼万年青总皂苷的纯化及抗氧化活性研究

天然产物研究与开发 2016年第3期28卷 404-408页

作者：曲中原张逸乔邹翔石鑫方月妮刘欣季宇彬哈尔滨商业大学药学院哈尔滨商业大学国家教育部抗肿瘤天然药物工程研究中心哈尔滨商业大学药物研究所博士后科研工作站哈尔滨150076

对虎眼万年青总皂苷的纯化工艺及抗氧化活性进行研究。以比吸附量和比洗脱量为指标,筛选大孔树脂型号,进一步优化工艺条件。结果表明,AB-8型大孔树脂对虎眼万年青总皂苷具有良好的吸附和洗脱效果,最佳纯化条件为药材量与树脂用量比不超... 详细信息

对虎眼万年青总皂苷的纯化工艺及抗氧化活性进行研究。以比吸附量和比洗脱量为指标,筛选大孔树脂型号,进一步优化工艺条件。结果表明,AB-8型大孔树脂对虎眼万年青总皂苷具有良好的吸附和洗脱效果,最佳纯化条件为药材量与树脂用量比不超过7∶1,用水、30%乙醇除杂,70%乙醇洗脱,在此条件下得到的虎眼万年青总皂苷纯度为55.18%。对纯化后虎眼万年青总皂苷的抗氧化活性进行研究,发现虎眼万年青总皂苷对羟自由基、超氧自由基阴离子和DPPH自由基的IC_(50)分别为2.43、2.28和0.05 mg/m L,具有良好的抗氧化活性。

关键词：虎眼万年青总皂苷大孔吸附树脂纯化抗氧化活性

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虎眼万年青品种观赏性状相关性及主成分分析

中南农业科技 2023年第6期44卷 59-62页

作者：高平王鑫姿黄远祥周素清黄靖琪万圣杰四川天艺生态园林集团股份有限公司成都610041 成都市花木技术服务中心成都610000

研究不同虎眼万年青品种的主要观赏性状,以期为虎眼万年青育种提供指导。以196份虎眼万年青属种质资源为试验材料,对其13个观赏性状进行变异系数、相关性分析及主成分分析。结果表明,13个观赏性状变异系数为10.14%~60.42%,其中花瓣长的... 详细信息

研究不同虎眼万年青品种的主要观赏性状,以期为虎眼万年青育种提供指导。以196份虎眼万年青属种质资源为试验材料,对其13个观赏性状进行变异系数、相关性分析及主成分分析。结果表明,13个观赏性状变异系数为10.14%~60.42%,其中花瓣长的变异系数最大。相关性分析表明,小花数与叶长、叶宽、花序长、葶粗均呈极显著正相关(P虎眼万年青品种观赏性的主要指标。量化分析观赏性状有助于育种者充分了解材料性状,便于选择育种亲本。

关键词：虎眼万年青观赏性状相关性分析主成分分析

虎眼万年青通过抑制CYP2E1和HIF-1α保护对乙酰氨基酚诱导的急性肝损伤(英文)

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中国天然药物 2012年第3期10卷 177-184页

作者：宛莹吴艳玲廉丽花南极星延边大学长白山生物资源与功能分子教育部重点实验室延吉133002

目的:通过对乙酰氨基酚体内体外实验建立急性肝损伤模型,观察虎眼万年青总皂苷的肝保护作用。方法:体内实验,小鼠预先口服给予虎眼万年青总皂苷(300,200,100mg·kg-1)或N-乙酰-L-半胱氨酸(300mg·kg-1)3次,每次间隔24小时,末次给药后2... 详细信息

目的:通过对乙酰氨基酚体内体外实验建立急性肝损伤模型,观察虎眼万年青总皂苷的肝保护作用。方法:体内实验,小鼠预先口服给予虎眼万年青总皂苷(300,200,100mg·kg-1)或N-乙酰-L-半胱氨酸(300mg·kg-1)3次,每次间隔24小时,末次给药后2小时腹腔注射对乙酰氨基酚。体外实验,张氏肝细胞培养在含有虎眼万年青(50,100,200mg·mL-1)或N-乙酰-L-半胱氨酸(10mmol·L-1)的培养基中,同时加入对乙酰氨基酚(10mmol·L-1)培养24小时。结果:虎眼万年青总皂苷在对乙酰氨基酚诱导肝损伤12小时后具有较强的肝保护作用,抑制了血清中谷草转氨酶和谷丙转氨酶的活性,减少了脂质过氧化物的生成,提高了过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性,抑制了细胞凋亡蛋白酶caspase-3和缺氧诱导因子-1α的表达。体外实验结果显示虎眼万年青总皂苷显著减少了对乙酰氨基酚代谢过程中关键酶细胞色素P4502E1的活性及环氧化酶2的表达。结论:虎眼万年青总皂苷对对乙酰氨基酚诱导的肝损伤具有保护作用其肝保护作用机制可能与抗氧化,抑制细胞色素P4502E1的活性和减少缺氧诱导因子1α的生成有关。

关键词：虎眼万年青对乙酰氨基酚凋亡细胞色素P4502E1 缺氧诱导因子-1α

虎眼万年青属糖基转移酶的挖掘及其在糖苷多样性中的应用

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虎眼万年青属糖基转移酶的挖掘及其在糖苷多样性中的应用

作者：袁帅北京协和医学院

学位级别：硕士

天然产物的糖基化修饰在动物、植物及微生物中广泛存在。经糖基化修饰后的小分子化合物往往具有较好的药理活性、较高的生物利用度及较小的毒副作用。在生物体中,糖基化过程由具有不同功能的糖基转移酶来完成。通过深入研究各种糖基转... 详细信息

天然产物的糖基化修饰在动物、植物及微生物中广泛存在。经糖基化修饰后的小分子化合物往往具有较好的药理活性、较高的生物利用度及较小的毒副作用。在生物体中,糖基化过程由具有不同功能的糖基转移酶来完成。通过深入研究各种糖基转移酶的功能及性质,突出其优点从而实现以合成生物学技术制备天然糖苷产物。本文围绕从虎眼万年青属(Ornithogalum)植物中克隆得到的糖基转移酶基因OcUGT1和OsUGT1展开探索,对其进行功能鉴定、酶学特征分析等研究。我们发现OcUGT1不仅可以利用UDP-糖实现经典的糖基化反应,同时还能在不添加UDP或UDP-糖的条件下利用廉价糖苷发生转糖反应实现糖基化。此外,OcUGT1还可以催化三种可逆反应,即UDP-糖合成反应、糖基或符元交换反应和水解反应。OsUGT1作为橙酮糖基转移酶,可以特异性地催化硫磺菊素发生糖基化反应,且同样具有转糖及水解活性。该结果的发现表明OcUGT1和OsUGT1兼具糖基转移酶及糖苷酶双重活性,拓宽了糖基转移酶的应用前景,且其多种活性的验证为后续利用合成生物学技术实现小分子糖苷的规模化制备打下坚实的基础。1.虎眼万年青Ornithogalum caudatum中多功能黄酮糖基转移酶OcUGT1的分离及功能鉴定糖基转移酶作为一种双向生物催化剂可以催化多种小分子化合物的糖基化反应。然而在糖苷合成的过程中,糖基转移酶的应用往往受限于其需要昂贵的NDP-糖或NDP作为底物参与反应。在此,为了鉴定参与天然产物糖基化过程的糖基转移酶,我们从虎眼万年青中得到了黄酮糖基转移酶OcUGT1,它可以在不需要额外添加NDP-糖或NDP的情况下,利用糖苷实现转糖反应。此外,OcUGT1还展现出了额外五种功能,包括经典的糖基化反应和三种可逆反应,即NDP-糖合成反应、糖交换和苷元交换反应,以及水解反应。以上结果表明OcUGT1兼具糖基转移酶和糖苷酶活性。2.通过OcUGT1催化糖基化和转糖反应生物合成7,8-二羟基黄酮糖苷OcUGT1可以通过糖基化和转糖反应催化7,8-二羟基黄酮的C-8位发生糖基化。OcUGT1催化7,8-二羟基黄酮糖基化反应形成两个单糖苷,7,8-二羟基黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷和7,8-二羟基黄酮-8-O-β-D-葡萄糖苷以及一个二糖苷7,8-二羟基黄酮-7,8-O-β-D-二葡萄糖苷。通过分子间转糖反应,同样可以催化形成两个单糖苷。3.OcUGT1催化睾酮与备选供体底物间的糖基化反应睾酮-17-O-β-D-葡萄糖苷是睾酮-17-O-β-D-葡萄糖-3’-乙酰这个具有抗肿瘤活性化合物的前体物质。我们已利用糖基转移酶催化睾酮和UDP-葡萄糖发生反应,通过生物合成方式获得睾酮糖苷。然而在此过程中对于昂贵的UDP-葡萄糖较低的利用度往往限制了乙酰化睾酮糖苷成药性的研究。因此,发现可替换的廉价糖基供体之于睾酮糖苷生物合成过程的研究是极为迫切的。虎眼万年青来源的黄酮糖基转移酶OcUGT1作为一种生物催化剂,可以催化睾酮与多种糖基供体间发生反应。实验结果表明,OcUGT1可以催化睾酮与UDP-葡萄糖经糖基化反应形成睾酮-17-O-β-D-葡萄糖苷和一个二糖苷。同时,睾酮与邻硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷及对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷通过转糖反应,也可得到相应糖苷产物。4.桑多斯虎眼万年青Ornithogalum saundersiae中橙酮糖基转移酶的发掘及功能鉴定橙酮糖苷具有多种生物活性。然而关于糖基转移酶催化橙酮糖基化反应的报道却很有限。我们从桑多斯虎眼万年青中分离得到的OsUGT1,通过保守结构域分析表明OsUGT1属于黄酮糖基转移酶的进化分支,但却并未与已知的黄酮糖基转移酶成簇,这也暗示着其作为一个新的分支催化橙酮类化合物发生糖基化反应。体外酶催化反应结果表明OsUGT1可以催化硫磺菊素形成相应单糖苷,同时其还可以催化黄酮类化合物的糖基化反应。此外,OsUGT1还具有糖苷酶活性,具有分子间转糖和水解功能。

关键词：糖基转移酶糖苷酶糖基化虎眼万年青转糖反应

虎眼万年青总皂苷对结肠癌细胞自噬及凋亡的影响及相关机制研究

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虎眼万年青总皂苷对结肠癌细胞自噬及凋亡的影响及相关机制研究

作者：刘哲大连医科大学

学位级别：硕士

研究目的:虎眼万年青具有显著的抗肿瘤活性,其皂苷类化合物是主要有效成分之一,本实验目的在于研究虎眼万年青鳞茎和叶各自总皂苷对结肠癌的抗癌活性,观察其对结肠癌细胞凋亡、自噬的影响,以初步探讨抗结肠癌的作用机理以及寻找发现新... 详细信息

研究目的:虎眼万年青具有显著的抗肿瘤活性,其皂苷类化合物是主要有效成分之一,本实验目的在于研究虎眼万年青鳞茎和叶各自总皂苷对结肠癌的抗癌活性,观察其对结肠癌细胞凋亡、自噬的影响,以初步探讨抗结肠癌的作用机理以及寻找发现新的有效药用部位。方法:1.结肠癌裸鼠模型的制备、标本收集与相关指标测定;药物虎眼万年青总皂苷(OCA-TS)的提取。(1)制备模型、收集标本:每只裸鼠腋窝皮下接种为1×10/0.1ml混悬肿瘤细胞0.1ml。当裸鼠肿瘤体积达到100 mm时,认为荷瘤成功,将荷瘤裸鼠随机分为5组:模型组、阳性药组、OCA-TS组。根据分组分别进行药物灌胃处理,每天1次。药物处理7d后处死各组荷瘤裸鼠,收集各组裸鼠血清样本;取肿瘤组织及癌旁组织。肿瘤组织和癌旁组织部分10%中性甲醛溶液固定,部分液氮速冻转至-80℃保存备用。(2)用HE染色观察虎眼万年青总皂苷对肿瘤组织结构及细胞形态的影响;Western blot法检测肿瘤组织中ATG5、LC3 II/I、Beclin1、VDAC1的表达量;免疫组化法检测VDAC1表达(3)采用乙醇热回流法提取虎眼万年青鳞茎和叶中各自总皂苷(TS)成分。2.虎眼万年青总皂苷对结肠癌细胞系生长增殖、凋亡与自噬影响的检测:(1)细胞形态学检测:MTT比色法检测OCA-TS鳞茎和叶分别对结肠癌细胞增殖的影响;平板克隆形成实验(PCF)检测OCA-TS对结肠癌细胞Lo Vo的克隆形成能力;Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞仪检测OCA-TS对人结肠癌细胞系凋亡与周期的影响。(2)Western Blotting法检测OCA-TS作用人结肠癌细胞后凋亡及自噬相关蛋白的表达情况;透射电镜下观察OCA-TS对人结肠癌细胞超微结构的影响以及观察自噬溶酶体的形成;用Ad-mCherry-GFP-LC3B腺病毒追踪OCA-TS作用人结肠癌细胞后产生的自噬流的变化结果:1.OCA-TS组用0.1g/kg、1 g/kg、10g/kg每日灌胃给药1次,各组连续给药7天,对裸鼠体内肿瘤的生长均具有抑制作用,10g/kgOCA-TS组肿瘤体积抑制率已接近阳性药组的54.95%;HE染色结果显示给药组细胞细胞核分裂明显减少,活跃度降低;Western-blotting结果显示:各组用药小鼠肿瘤组织中均有ATG5、LC3II/I、Beclin1等自噬相关蛋白的表达,且呈上调趋势;免疫组化结果,用药组VDAC-1蛋白阳性表达呈现染色棕黄色、棕褐色颗粒。2.(1)MTT结果显示虎眼万年青鳞茎和叶分别提取出的OCA-TS均能够抑制四种结肠癌细胞的增殖,并呈现出时间浓度的依赖,OCA-TS叶作用48h,IC分别为:RKO,1.28mg/ml;Caco-2,0.96mg/ml;HCT116,0.96mg/ml;LoVo,0.96mg/ml;OCA-TS鳞茎作用48h,IC分别为:RKO,1.17mg/ml;Caco-2,1.00mg/ml;HCT116,0.97mg/ml;LoVo,0.64mg/ml。OCA-TS鳞茎作用活性稍高于叶,Lo Vo细胞对药物作用更为敏感。LoVo细胞在OCA—TS作用以后,各组细胞克隆形成率明显下降,与MTT结果一致,也具有浓度依赖性。(2)OCA-TS诱导Lo Vo细胞凋亡,尤其早期凋亡明显,1mg/mlOCA-TS用药组,总凋亡率接近50%(P虎眼万年青鳞茎和叶总皂苷提取物均具有抗肿瘤活性。四种结肠癌细胞对OCA-TS的作用存在敏感性差异,其中Lo Vo细胞对不同浓度的OCA-TS反应更为敏感。3.OCA-TS能够诱导LoVo细胞凋亡,调控Bcl-2家族抗凋亡蛋白Bcl-2以及促凋亡蛋白Bax等的综合表达可能是其抗癌作用的可能机制之一4.OCA-TS对结肠癌体内体外都具有的抗癌活性,还可能与其都够诱导结肠癌细胞发生自噬有关。

关键词：虎眼万年青总皂苷结肠癌凋亡自噬

虎眼万年青中新型黄酮醇合酶家族的挖掘及功能表征

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虎眼万年青中新型黄酮醇合酶家族的挖掘及功能表征

作者：孙宇佳北京协和医学院

学位级别：硕士

2-氧化戊二酸依赖型氧化酶家族是自然界中第二大氧化酶家族。该家族中的一大类酶参与植物类黄酮的次级代谢过程。类黄酮化合物已被证实具有多种药理活性。结合已有研究,本课题重点着眼于发掘高效新颖黄酮醇合酶。以富含黄酮类化合物的... 详细信息

2-氧化戊二酸依赖型氧化酶家族是自然界中第二大氧化酶家族。该家族中的一大类酶参与植物类黄酮的次级代谢过程。类黄酮化合物已被证实具有多种药理活性。结合已有研究,本课题重点着眼于发掘高效新颖黄酮醇合酶。以富含黄酮类化合物的植物虎眼万年青(Ornithogalum caudatum Jacq)为植物材料,从中挖掘得到了一个具有铁不依赖型二氢黄酮3β羟化酶功能的黄酮醇合酶家族。1、虎眼万年青黄酮醇合酶基因的克隆及表达转录组序列挖掘获得可能编码黄酮醇合酶的13条候选基因序列;提取植物总RNA;以RNA逆转录获得的cDNA为模板,通过巢式克隆得到13条相似基因。成功构建了其中10条基因的原核表达载体,并完成了其中6个重组蛋白的可溶性表达工作。2、虎眼万年青黄酮醇合酶家族的功能表征通过构建体外酶促反应体系,以二氢黄酮醇香橙素为底物验证重组蛋白的黄酮醇合酶功能,以二氢黄酮柚皮素为底物验证其二氢黄酮3β羟化酶功能。获得两个具有体外活性的虎眼万年青黄酮醇合酶,将其分别命名为OcFLS1和OcFLS2。对于OcFLS1和OcFLS2又选择了 17个黄酮类的化合物进行了功能宽泛性的探究,证明其仅对二氢黄酮和二氢黄酮醇类具有底物宽泛性。研究主要采用HPLC进行分析,通过LC-MS结合反应产物与标准品共进样对反应产物结构进一步确定。3、OcFLSs相关酶学性质研究针对OcFLS1和OcFLS2两种功能的体外酶促反应,对其酶学性质进行探究。首先测定了反应温度、pH对两种功能活性的影响。结果表明相较于高温该家族酶对低温的耐受性更强,且两种功能的体外反应最适温度均为20℃;该家族酶体外反应更适合弱酸性环境,最适pH为6.0。然后又探究了反应体系中的辅因子对该家族酶双功能活性的影响,发现了 OcFLSs是具有铁不依赖型二氢黄酮3β羟化酶活性的新型双功能黄酮醇合酶家族。不同二价金属离子对OcFLSs两种功能的体外活性影响测定结果表明除了 Mg2+ Ca2+对二氢黄酮3β羟化酶功能几乎没有抑制作用之外,一些常见的二价金属离子对体外活性均有抑制作用,其中Cu2+抑制作用最强。分别以香橙素为底物进行的黄酮醇合酶功能的反应,以柚皮素为底物进行的二氢黄酮3β羟化酶功能的反应,对OcFLS1和OcFLS2均进行了酶促动力学参数的测定,得到了每个反应的Km及Vmax值。4、OcFLSs表达模式研究通过荧光实时定量PCR手段,检测OcFLS1和OcFLS2基因在虎眼万年青O.caudatum根、鳞茎、叶、花、子鳞茎以及无菌鳞茎中的表达水平,从而推断蛋白OcFLS1和OcFLS2在植物中的表达模式。实验结果表明OcFLS1和OcFLS2广泛存在于叶片组织中,而在子鳞茎、根和无菌鳞茎中几乎不存在,这也验证了该酶可能参与植物体中抗紫外和抗逆功能。

关键词：虎眼万年青黄酮醇合酶二氢黄酮3β羟化酶铁不依赖性

虎眼万年青对人非小细胞肺癌H1299细胞增殖与凋亡的影响及机制研究

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虎眼万年青对人非小细胞肺癌H1299细胞增殖与凋亡的影响及机制研究

作者：王瑜延边大学

学位级别：硕士

目的虎眼万年青是一种天然中草药植物,其多种化学成分已被证实具有强效抗癌活性,探讨虎眼万年青鳞茎及叶醇提物对人非小细胞肺癌H1299细胞增殖抑制、凋亡作用及机制。方法应用MTT法测定不同浓度、不同时间段虎眼万年青鳞茎及叶醇提物对... 详细信息

目的虎眼万年青是一种天然中草药植物,其多种化学成分已被证实具有强效抗癌活性,探讨虎眼万年青鳞茎及叶醇提物对人非小细胞肺癌H1299细胞增殖抑制、凋亡作用及机制。方法应用MTT法测定不同浓度、不同时间段虎眼万年青鳞茎及叶醇提物对人肺腺癌H1299细胞株的增殖抑制作用;倒置显微镜观察肺癌H1299细胞形态变化,荧光显微镜观察H1299细胞凋亡变化;流式细胞术观察虎眼万年青醇提物对H1299细胞的凋亡诱导作用;Western Blot检测经虎眼万年青醇提物处理后H1299细胞凋亡相关蛋白（Bcl-2、Bax、Bad蛋白）的表达情况;实时荧光定量法（RT-PCR）检测经虎眼万年青醇提物处理后H1299细胞凋亡相关基因（Bcl-2、Bax、Bad）的表达情况。结果MTT结果显示,虎眼万年青鳞茎及叶醇提物作用于人肺腺癌H1299细胞后,48h及72h浓度为0.5、1、2、5、10mg/mL时细胞活性与空白对照组相比明显降低,且差异具有统计学意义（P＜0.05、P＜0.01）;溶媒组（DMSO＜0.1%）与空白对照组相比,差异无统计学意义（P＞0.05）。倒置显微镜显示加药组细胞生长明显受抑制,细胞形态发生改变;荧光显微镜及流式细胞术显示,虎眼万年青鳞茎及叶醇提物正丁醇相可促进H1299细胞凋亡;Western Blot结果显示经虎眼万年青醇提物处理后H1299细胞中Bcl-2蛋白表达下降、Bax蛋白无明显变化、Bad蛋白表达升高,Bax/Bcl-2比值升高;实时荧光定量法（RT-PCR）检测结果显示经虎眼万年青处理后H1299细胞中Bcl-2 mRNA表达下降、Bax mRNA无明显变化、Bad mRNA表达升高,Bax/Bcl-2比值升高。结论1.体外实验表明,虎眼万年青叶及鳞茎醇提物均可抑制人非小细胞肺癌H1299细胞增殖及促进凋亡,且具有浓度依赖性;2.Bcl-2家族部分基因及蛋白共同参与虎眼万年青叶及鳞茎醇提物诱导H1299细胞凋亡的过程。

关键词：虎眼万年青肺癌凋亡 Bcl-2 Bad Bax

虎眼万年青中蔗糖合酶基因的克隆、表达及功能鉴定

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虎眼万年青中蔗糖合酶基因的克隆、表达及功能鉴定

作者：李丽娜北京协和医学院

学位级别：硕士

大量研究表明,药物的糖基化修饰在提高药物活性、提高生物利用度、降低毒副作用等方面发挥着至关重要的作用,而用于药物糖基化修饰的核苷酸单糖供体（包括UDP-葡萄糖,UDP-葡萄糖醛酸,UDP-木糖、UDP-阿拉伯糖、UDP-芹菜糖、UDP-半乳糖醛... 详细信息

大量研究表明,药物的糖基化修饰在提高药物活性、提高生物利用度、降低毒副作用等方面发挥着至关重要的作用,而用于药物糖基化修饰的核苷酸单糖供体（包括UDP-葡萄糖,UDP-葡萄糖醛酸,UDP-木糖、UDP-阿拉伯糖、UDP-芹菜糖、UDP-半乳糖醛酸）则存在含量稀少、提取繁琐和合成困难等问题,这种不易得性限制了药物糖基化的进一步研究,不利于创新药物的研制和社会可持续发展的需要。但是,合成生物学技术的出现为该问题的解决提供了新的思路和方法。依据解析生物合成途径,得到相关关键酶的信息,对相关的关键酶基因进行研究和组装,就可实现上述核苷单糖的规模化制备。我们在对上述核苷单糖的生物合成途径进行解析时发现,UDP-葡萄糖、UDP-葡萄糖醛酸是合成上述所有核苷单糖的前体。因此,进一步解析UDP-葡萄糖,UDP-葡萄糖醛酸的生物合成途径,并对合成途径中的相关基因进行研究,是利用合成生物学技术合成上述核苷单糖的关键。在3条核苷单糖合成途径中,因蔗糖合酶途径最短,仅需一步反应就可生成UDP-葡萄糖,而UDP-葡萄糖在其它酶的进一步催化下可以生成多种核苷单糖,在核苷单糖的生物合成途径中处于核心的地位。因此对蔗糖合酶基因进行研究可为最终的利用合成生物学技术制备核苷单糖打下良好的开端。1、蔗糖合酶基因家族的克隆及表达依据虎眼万年青转录组测序得到的数据,通过提取虎眼万年青总mRNA,逆转录得到cDNA.设计引物,利用巢式PCR克隆得到3条蔗糖合酶基因（OcSus）。利用In-Fusion原理设计引物,构建了原核表达载体。通过直接表达或与分子伴侣共表达的形式,实现了OcSus1、OcSus2和OcSus3可溶性表达。2、蔗糖合酶基因家族的功能鉴定依据蔗糖合酶催化可逆反应这一特点,分别从蔗糖合成反应方向及分解反应方向对OcSus1-3功能进行了鉴定。利用硫酸蒽酮法对合成反应方向进行功能鉴定,初步确定OcSus1-3均具有合成蔗糖的功能。对于蔗糖分解方向的反应,我们利用反相离子对色谱进行检测。并进一步通过质谱及反应产物与标准品共进样的方式对反应产物进行进一步确认,确定了OcSus1-3具有分解反应的功能。综上,OcSus1-3均具有蔗糖合酶功能。3、蔗糖合酶基因家族分解反应底物偏好性研究利用OcSus1、OcSus2和OcSus3分别对蔗糖和ADP、TDP、GDP、CDP、UDP进行催化,研究三者催化分解反应的底物偏好性。结果发现,三者均可对UDP进行催化,此外OcSus1还可对TDP进行催化,但是反应效率低于以蔗糖和UDP为底物的反应效率。4、蔗糖合酶基因家族分解反应酶学性质研究OcSus1-3催化蔗糖分解反应的最适温度,最适pH不尽相同。其中,OcSus1和OcSus3催化蔗糖分解反应的最适温度均为50℃,而OcSus2为37℃。对于催化蔗糖分解反应的最适pH, OcSu s1和OcSus2均为7.0,而OcSus3为5.0。此外,我们还测定了不同浓度二价金属离子对OcSus1-3催化蔗糖分解反应的影响,除Ca2+对三者具有一定的促进作用外,其余二价金属离子均产生了一定的抑制作用。我们还对OcSus1-3催化蔗糖分解方向的酶促动力学参数进行了测定。结果表明,OcSus1、OcSus2和OcSus3勺UDP的Km值均低于蔗糖的Km值,即三者对UDP的亲和力均高于蔗糖。此外OcSus2在三者之中对UDP的亲和力最高,而OcSus1则是在三者之中对蔗糖的亲和力最高的,并且OcSus1的Vmax最高,说明其在三者中的催化效率较高。5、蔗糖合酶基因家族的表达模式研究利用RT-qPCR的方法,通过检测OcSus1-3在O. caudatum不同组织中的表达水平,研究了OcSusl-3的表达模式,从而进一步推断三者在O. caudatum可能具有的生理功能。研究结果表明,OcSus1和OcSus2可能负责O. caudatum中OCAP-2-1, OCAP-2-2, OCAP-3-1和OCAP-3-3这类含葡萄糖的多糖的生物合成;OcSus3则可能在植物生长发育过程中发挥着一定的作用。

关键词：虎眼万年青核苷单糖蔗糖合酶功能鉴定