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作者：牛鸿婧天津医科大学

学位级别：硕士

目的:Exosome是一种大小在40-100 nm之间的囊泡状膜结构,不同细胞来源的exosome含有不同的蛋白和RNA成分。Exosome在抗原呈递、细胞间信息传递和运输等过程中起着重要的作用。由于exosome能够获取源细胞中的多种蛋白或RNA（mRNA和micro... 详细信息

目的:Exosome是一种大小在40-100 nm之间的囊泡状膜结构,不同细胞来源的exosome含有不同的蛋白和RNA成分。Exosome在抗原呈递、细胞间信息传递和运输等过程中起着重要的作用。由于exosome能够获取源细胞中的多种蛋白或RNA（mRNA和microRNA）,并进行细胞间传递,是细胞内信使及内源性蛋白和RNA的运输载体。因此我们在前期工作中,利用小鼠未成熟树突状细胞来源的exosome作为运输载体,来尝试运输外源siRNA药物。通过对exosome特异性靶向修饰,赋予其靶向脑神经的能力,从而成功地将siRNA运输到脑神经中,介导特异性靶基因下调,证明exosome可以作为外源基因的运输载体。因此在本论文中,我们尝试利用exosome运输反义寡核苷酸药物,并以杜兴肌肉萎缩症（DMD）作为疾病测试模型评估exosome作为反义寡核苷酸药物载体的能力和潜力。DMD是由dystrophin基因突变导致的dystrophin蛋白缺失所引发的一种致死性神经肌肉失调症,到目前为止,临床上未有任何有效的治疗方法。反义寡核苷酸介导的外显子跳读的治疗方法是最有应用前景的治疗方法之一,已处于临床Ⅲ期试验,结果喜人。然而临床上测试的反义寡核苷酸药物存在系统运输效率低的问题,本研究拟以exosome作为反义寡核苷酸药物的运输载体,以期提高反义寡核苷酸药物在肌肉中的系统运输效率。方法:1.Exosome的制备：利用多步超速离心法。首先通过1000 g,15 mins离心去除细胞碎片;取上清,利用12,000 g,20 mins离心后,再用0.22 μm滤膜过滤,去除杂质;收集上清,通过100,000 g,超速离心70 mins,用PBS重悬沉淀,获得 exosome。2.Exosome的生化鉴定:利用exosome的标志性蛋白Alix和TSG101,通过Western Blot来检测exosome的存在;为确定无细胞碎片的污染,使用细胞器线粒体中的蛋白Cytochrome C作为检测指标。3.Exsome的形态鉴定:利用透射电子显微镜观察exosome形态特征。将醋酸铵重悬的exosome滴加到附有碳膜的铜网上5 mins,弃去剩余液体后自然干燥。滴加1%磷钨酸染液2 mins,弃去染液,干燥后用透射电镜观察。4.Exosome的密度确认:利用蔗糖梯度离心的方法,检测exosome的密度。制备1.07-1.25 g/mL的蔗糖密度梯度溶液,按密度由大到小依次加入到超速离心管,在最上层加入一定量exosome悬浮液,经100,000 g,16 h超速离心,分别收集每一密度梯度层的蔗糖溶液,并将其中的exosome沉淀、分离,用PBS重悬定量。5.Exosome进入源细胞的能力测试:使用膜特异标记染料PKH67对肌肉细胞来源的exosome进行标记,并加入到肌肉细胞C2C12中,在不同时间点观察其进入细胞情况,确定exosome进入其源细胞的最佳时间点。6.Exosome在细胞内的定位:将PKH67标记的exosome加入肌肉细胞,利用细胞器例如溶酶体特异标记染料和早期内体（Early Endosome）特异标记染料,来检测exosome在细胞内的位置。7.Exosome的细胞或组织趋向性分析:检测PKH67标记的exosome进入不同细胞包括肌肉细胞、脂肪前体细胞及成纤维细胞的能力。通过荧光显微镜和流式细胞分析确定肌肉细胞来源的exosome的细胞趋向性;并检测荧光标记exosome在mdx小鼠中各组织中的分布情况,以确定肌肉细胞来源的exosome是否具有肌肉趋向性。8.Exosome运输反义寡核苷酸药物的体外检测:通过电击转化的方法将反义寡核苷酸装载入exosome,并在DMD细胞模型中检测其运输反义寡核苷酸药物的效率。9.Exosome运输反义寡核苷酸药物的体内局部检测:将装载反义寡核苷酸的exosome通过肌肉局部注射,注射到mdx小鼠前径骨肌中,两周后取样检测。通过免疫组织化学染色法和RT-PCR检测模型小鼠肌肉纤维的恢复情况及外显子跳读的效率。结果:1.通过多步离心法,从细胞的培养上清中提取到exosome,并通过蛋白定量的方法,确定每毫升细胞培养上清可提取5 μg exosome。2.通过Western Blot方法,利用exosome标志性蛋白Alix和TSG101,确定获得了肌肉细胞来源的exosome;同时通过检测细胞器上的特征性蛋白Cytochrome C,来证实所提取的exosome中无细胞碎片污染。3.通过蔗糖密度梯度离心的方法来纯化exosome,获得的exosome密度与报道一致。Western Blot实验结果确认,蔗糖梯度纯化的exosome悬浮在蔗糖密度梯度为1.13-1.19 g/mL之间,与报道的exosome密度范围一致,从而进一步确认exosome的存在。4.通过荧光显微镜实时监测PKH

关键词： Exosome 超速离心杜兴肌肉萎缩症蔗糖密度梯度离心电击转化

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抗小鹅瘟病毒单克隆抗体的制备及胶体金免疫层析试纸条的研制

抗小鹅瘟病毒单克隆抗体的制备及胶体金免疫层析试纸条的研制

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作者：刘飞南京农业大学

学位级别：硕士

小鹅瘟是由细小病毒科、依赖病毒属中的鹅细小病毒引起的一种高度接触性和败血性传染病,主要侵害4～20日龄内的雏鹅和雏番鸭,引起急性肠炎及肝脏、肾脏、心脏等实质脏器败血性病变,尤其以小肠部位的纤维性、栓塞性病变为主要特征,发病... 详细信息

小鹅瘟是由细小病毒科、依赖病毒属中的鹅细小病毒引起的一种高度接触性和败血性传染病,主要侵害4～20日龄内的雏鹅和雏番鸭,引起急性肠炎及肝脏、肾脏、心脏等实质脏器败血性病变,尤其以小肠部位的纤维性、栓塞性病变为主要特征,发病率和死亡率可高达90%以上。目前,此病每年都有不同程度的流行,是养鹅及番鸭地区最主要的传染病之一,造成严重的经济损失。因该病主要感染雏鹅和雏番鸭,所以,该病的早期诊断显得极为重要。本试验用GPV南京分离株(NJ株)接种非免疫鹅胚,将收获的病毒尿囊液与等量氯仿混合,除去杂蛋白,加入氯化钠使其浓度达到2.2%,用终浓度6%PEG-6000将绝大部分病毒沉降下来,通过蔗糖密度梯度超速离心对病毒进行纯化。经PCR检测及电镜观察,发现病毒主要分布在35%～50%蔗糖浓度之间,病毒的蛋白含量为216μg/ml,SDS-PAGE电泳分析,证明病毒的纯度达到90%以上,达到实验要求。将提纯浓缩后的小鹅瘟病毒用甲醛灭活,免疫6周龄BALB/c雌性小鼠,制备免疫脾细胞,与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA筛选,获得3株能稳定分泌抗小鹅瘟病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1E12/2H11和3F1。腹水效价分别为1：32000、1：80000和1：16000;间接免疫荧光试验证明该三株单抗均有良好的特异性;western blot证明这三株单抗均针对鹅细小病毒结构蛋白VP3。选取效价高的单克隆抗体2H11进行纯化,制备金标抗体玻璃纤维素膜;将纯化的兔抗小鹅瘟多抗固定于硝酸纤维素膜(NC)上作为捕获抗体,制作成双抗夹心法GPV胶体金免疫层析试纸条。用该试纸条可特异性检测小鹅瘟病毒,在10～15min内可得到检测结果,敏感度为104.1GELD50/0.2ml。该试纸条特异性高,重复性好,可用于GP的临床快速诊断。

关键词：小鹅瘟病毒蔗糖密度梯度离心单克隆抗体胶体金免疫层析试纸条

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TGEV细胞培养物超速离心与RT-PCR扩增的研究

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动物医学进展 2007年第4期28卷 50-52页

作者：蒋凤英何锡忠王英李春华钱永清邹勇上海农科院畜牧兽医研究所上海201106

研究猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)细胞培养物的超速离心及鉴定方法。将TGEV的细胞培养物用饱和硫酸氨法浓缩后,用200 g/kg^500 g/kg蔗糖密度梯度离心分装,测定蛋白浓度并取峰值管进行RT-PCR,并设立15、25、35三个不同循环参数测定PCR产物vo... 详细信息

研究猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)细胞培养物的超速离心及鉴定方法。将TGEV的细胞培养物用饱和硫酸氨法浓缩后,用200 g/kg^500 g/kg蔗糖密度梯度离心分装,测定蛋白浓度并取峰值管进行RT-PCR,并设立15、25、35三个不同循环参数测定PCR产物volume值。结果表明,在35个循环条件下第14号样品PCR产物的volume值最大,表明该样品病毒核酸的含量最大,由此推算病毒粒子主要集中在360 g/kg^380 g/kg蔗糖区带处,这与理论值相符,证明猪传染性胃肠炎病毒经密度区带离心后,利用PCR产物量确定目的病毒区带效果显著。

关键词：猪传染性胃肠炎病毒蔗糖密度梯度离心 RT-PCR

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喉癌Hep-2细胞来源的exosomes提取方法的比较

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临床耳鼻咽喉头颈外科杂志 2015年第17期29卷 1522-1526页

作者：梁俊毅吉晓滨刘启才谢景华广州市第一人民医院耳鼻咽喉科广州510180 广州医科大学实验医学研究中心

目的:对分离提取喉癌Hep-2细胞来源的exosomes 2种方法进行对比,展现不同方法的优缺点,为选择分离提取包括喉癌Hep-2细胞在内的肿瘤细胞来源exosomes的方法提供参考。方法:大量培养喉癌Hep-2细胞,42℃热休克处理。收集90ml培养上清液,... 详细信息

目的:对分离提取喉癌Hep-2细胞来源的exosomes 2种方法进行对比,展现不同方法的优缺点,为选择分离提取包括喉癌Hep-2细胞在内的肿瘤细胞来源exosomes的方法提供参考。方法:大量培养喉癌Hep-2细胞,42℃热休克处理。收集90ml培养上清液,先通过3/0.8μm深层过滤小型滤芯对上清液进行预处理,去除直径较大的颗粒和杂质,再利用蔗糖密度梯度离心联合超滤离心法,将上清液浓缩提纯;收集培养上清液4ml,依次加入Exosome Isolation Kit内试剂,通过exosomes提取专用过滤柱,收集浓缩液。用高倍透射电子显微镜对2种方法所得的exosomes浓缩液分别鉴定,作出评价。结果:2种方法均能成功地从喉癌Hep-2细胞培养上清液中分离提取出exosomes。单个高倍视野下,蔗糖密度梯度离心联合超滤离心法提取exosomes分散性较好,但密度较低,背景见杂质较多;Exosome Isolation Kit所提取exosomes排列紧密,密度较高,背景杂质较少。结论:2种方法各具特点,均是较理想的exosomes分离提取方法。利用Exosome Isolation Kit分离提取exosomes具有样本量少、提取时间短、步骤简单、产物量大等优点,为喉癌Hep-2来源exosomes的分离提取提供了较好的选择。

关键词： exosomes 蔗糖密度梯度离心超滤离心 exosome Isolation Kit

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PSⅡ球囊体的分离提取及其特征测定

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上海农业学报 1987年第3期 25-30页

作者：孙鸿乔张克荣高国肖何苏复旦大学生物学系复旦大学生物学系上海上海八五届本科毕业生

用温和的去垢剂胆酸钠处理菠菜叶绿体,经差速和蔗糖密度梯度离心分离提取了具有释氧活性的 PSⅡ球囊体。PSⅡ球囊体的制备物具有 PSⅡ的吸收光谱、荧光光谱的特征和 PSⅡ特有的 EPR信号。PSⅡ球囊体制备物能光裂解水并把来自水的电子传... 详细信息

用温和的去垢剂胆酸钠处理菠菜叶绿体,经差速和蔗糖密度梯度离心分离提取了具有释氧活性的 PSⅡ球囊体。PSⅡ球囊体的制备物具有 PSⅡ的吸收光谱、荧光光谱的特征和 PSⅡ特有的 EPR信号。PSⅡ球囊体制备物能光裂解水并把来自水的电子传递给人工电了受体 FcCy,而不能传递给 MV,并含有释氧所需的16、23、33KD 蛋白质多肽。PSⅡ球囊体的分离提取为从结构和功能统一上研究植物的光合作用机理提供了一条新的途径。

关键词：菠菜蔗糖密度梯度离心 PS Ⅱ球囊体

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刺槐花叶病毒的研究——Ⅰ.病毒的分离纯化及其生物学和生物化学特性

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Acta Biochimica et Biophysica Sinica 1984年第6期 540-545页

作者：郑巧兮龚祖埙仝德全山东省林业科学研究所济南中国科学院上海生物化学研究所

刺槐花叶病毒是一种直径为30毫微米的球状病毒,其生物学特性为热致死温度60℃,稀释终点为10,体内保毒期为3～5天,体外保毒期为2天。用pH5.2重蒸水作为抽提液,结合聚乙二醇沉淀、超速离心及线性蔗糖梯度离心,可以将病毒分离提纯。病毒含... 详细信息

刺槐花叶病毒是一种直径为30毫微米的球状病毒,其生物学特性为热致死温度60℃,稀释终点为10,体内保毒期为3～5天,体外保毒期为2天。用pH5.2重蒸水作为抽提液,结合聚乙二醇沉淀、超速离心及线性蔗糖梯度离心,可以将病毒分离提纯。病毒含有RNA基因组,RNA含量约为13%,外壳蛋白为一种组分,分子量为30,000。根据刺槐花叶病毒的生物学特性及其外壳蛋白的分子量、氨基酸组成分析可以初步肯定我国的刺槐花叶病毒和国外报道的、以及大小相似的其他植物病毒不同,所以可能是一种未曾报道过的新病毒。

关键词：植物病毒花叶病毒氨基酸氨基羧酸外壳蛋白蔗糖密度梯度离心体外保毒期稀释限点稀释终点病毒形态球状病毒化学特性

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小麦全蚀病菌病毒的研究

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植物病理学报 1984年第3期18卷 159-164,194页

作者：梁平彦陈开英中国科学院微生物研究所

自山东泰安及烟台地区的小麦全蚀病菌中提取到两种类型颗粒,一类是球形至多边形的病毒颗粒,直径在22～45毫微米之间,多数为27～32毫微米;另一类是棒状颗粒,长度为40～185毫微米×16毫微米,平均108×16毫微米,提取的球形病毒具有核蛋白... 详细信息

自山东泰安及烟台地区的小麦全蚀病菌中提取到两种类型颗粒,一类是球形至多边形的病毒颗粒,直径在22～45毫微米之间,多数为27～32毫微米;另一类是棒状颗粒,长度为40～185毫微米×16毫微米,平均108×16毫微米,提取的球形病毒具有核蛋白的典型吸收光谱,最大和最小吸收值的波长分别在260毫微米和240毫微米,A260/240=1.24,A260/280=1.62。以烟台株病毒制备的抗血清,分别与烟台及泰安株病毒在琼脂免疫双扩散中作用均产生沉淀线,表明二者具有共同的血清型。烟台株病毒经苯酚抽提后的核酸样品最大吸收波长是260毫微米,最小是230毫微米,经聚丙烯酰胺—琼脂糖凝胶电泳分离为两条迁移率相近的带,表明此病毒有两个基因片断,在分类上属于需要两个dsRNA片断才能复制的等轴dsRNA真菌病毒。其外壳蛋白经测定含分子量70,000的多肽。从浙江、湖北等11个省(市)的12株全蚀病菌中均提取到了病毒,比较了各菌的菌落颜色,生长速度和病毒浓度。

关键词：抗血清小麦全蚀病菌烟台山东酚抽提溶剂精制泰安外壳蛋白蔗糖密度梯度离心双扩散

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家蚕细胞质多角体病毒及其RNA

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微生物学报 1978年第2期 129-133页

作者： Research Group of Virus Replication, Institute of Microbiology, Academia Sinica Section of Silkworm Pathology, Jiangsu Institute of Serieulture Beijing Zhenjiang 中国科学院微生物研究所病毒复制组江苏省蚕业研究所蚕病组

从感染细胞质多角体病毒（CPV）的家蚕的肠组织提取多角体,经碱处理后从中提纯了CPV。鉴定了CPV样品的紫外吸收特性、沉降性质,并在电镜下观察了CPV粒子的形态。从CPV提取的RNA经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,含有10个大小不同的片段。侵染... 详细信息

从感染细胞质多角体病毒（CPV）的家蚕的肠组织提取多角体,经碱处理后从中提纯了CPV。鉴定了CPV样品的紫外吸收特性、沉降性质,并在电镜下观察了CPV粒子的形态。从CPV提取的RNA经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,含有10个大小不同的片段。侵染性试验表明CPV具有侵染性,而CPV/-RNA没有侵染性。

关键词： CPV 紫外吸收凝胶电泳家蚕细胞蔗糖密度梯度离心质多角体病毒 RNA

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蓝隐藻PC645的存在状态及其聚集态复合物的分离

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烟台大学学报（自然科学与工程版） 2021年第4期34卷 412-420页

作者：王玉璇李琴王静张昆陈敏任慧慧郭志强烟台大学生命科学学院山东烟台264005

以蓝隐藻(Chroomonas placoidea)为材料,探索细胞中PC645的天然存在状态,以及聚合态PC645存在条件与细胞破碎和离心分离时盐浓度及pH变化的关系。吸收和荧光光谱分析显示,除了小分子的PC645异二聚体之外,在高密度蔗糖梯度区还发现有PC-... 详细信息

以蓝隐藻(Chroomonas placoidea)为材料,探索细胞中PC645的天然存在状态,以及聚合态PC645存在条件与细胞破碎和离心分离时盐浓度及pH变化的关系。吸收和荧光光谱分析显示,除了小分子的PC645异二聚体之外,在高密度蔗糖梯度区还发现有PC-叶绿素-蛋白复合物与大分子藻蓝蛋白复合物的混合条带,说明隐藻藻胆蛋白的天然状态包括游离异二聚体、聚合形式以及与膜结合的多种形式,且结合态的PC645与叶绿素之间保持着活性的能量传递状态。通过检测和比较PC645的660 nm特征荧光强度,发现该条带中大分子藻蓝蛋白复合物在破藻缓冲液磷酸盐浓度为50 mmol/L、pH 4.92,蔗糖密度梯度离心时磷酸盐缓冲液浓度为300 mmol/L、pH 4.92时含量最高。一定浓度的磷酸盐和pH小于6.5的酸性条件有利于藻蓝蛋白复合物的形成和稳定。实验结果将为深入了解隐藻藻胆蛋白的结构、组装和功能提供重要依据。

关键词：蓝隐藻 PC645 藻胆蛋白复合物 PC-叶绿素-蛋白复合物蔗糖密度梯度离心

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三种方法检测口蹄疫146S抗原含量及抗原稳定性的比较研究

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中国兽药杂志 2020年第6期54卷 33-41页

作者：杨生海柴静郭建荣王富强刘西兰董金杰张军翟国元张勇甘肃农业大学动物医学院兰州730070 中农威特生物科技股份有限公司兰州730046

为比较三种口蹄疫146S抗原含量检测方法,分别用蔗糖密度梯度离心结合安捷伦Cary 100紫外分光光度计定量法、蔗糖密度梯度离心结合安捷伦1260液相色谱仪定量法及高效液相体积排阻色谱法三种检测方法,对口蹄疫灭活抗原中的146S含量进行检... 详细信息

为比较三种口蹄疫146S抗原含量检测方法,分别用蔗糖密度梯度离心结合安捷伦Cary 100紫外分光光度计定量法、蔗糖密度梯度离心结合安捷伦1260液相色谱仪定量法及高效液相体积排阻色谱法三种检测方法,对口蹄疫灭活抗原中的146S含量进行检测,对三种检测方法的数据进行统计分析。将口蹄疫A型抗原和O型抗原各一株分别4℃放置12个月以及反复多次冷冻处理;口蹄疫抗原用全能核酸酶处理,然后用蔗糖密度梯度离心结合安捷伦1260液相色谱仪定量法检测处理前后的146S抗原含量变化。结果显示,三种检测方法的检测数值相关性极显著,呈正相关性;4℃放置12个月后的抗原含量没有变化,而反复多次冷冻处理后的抗原含量降解非常多;全能核酸酶处理后的抗原含杂蛋白少。本研究表明,基于临床需求,蔗糖密度梯度离心结合安捷伦1260液相色谱仪定量法更适合口蹄疫抗原检测;口蹄疫抗原适合于4℃保存;全能核酸酶能有效去除杂蛋白干扰,提高色谱纯化效率。

关键词：蔗糖密度梯度离心口蹄疫146S 安捷伦Cary 100紫外分光光度计安捷伦1260液相色谱仪高效体积排阻色谱全能核酸酶

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