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蔗糖密度梯度离心法纯化流感病毒工艺的优化

中国生物制品学杂志 2015年第8期28卷 848-851,855页

作者：顾建阳刘旭光郭占龙孙志伟杜金东徐文孙宇曹海丹刘燕曾亮王思燕王亚军长春生物制品研究所有限责任公司吉林长春130062

目的优化蔗糖密度梯度离心法纯化流感病毒的工艺参数。方法在不同进样量（600、700和800 ml）时,检测经蔗糖密度梯度离心纯化后各紫外检测峰的糖浓度、血凝滴度及卵清蛋白含量,并对血凝滴度大于1∶480的检测峰样品进行蛋白质含量和血凝... 详细信息

目的优化蔗糖密度梯度离心法纯化流感病毒的工艺参数。方法在不同进样量（600、700和800 ml）时,检测经蔗糖密度梯度离心纯化后各紫外检测峰的糖浓度、血凝滴度及卵清蛋白含量,并对血凝滴度大于1∶480的检测峰样品进行蛋白质含量和血凝素含量检测,确定最佳收峰位置、糖度范围及病毒浓缩液进样量;在不同比例的30%和50%的蔗糖溶液、不同离心时间（2、3和4 h）条件下对流感病毒浓缩液进行蔗糖密度梯度离心纯化,检测纯化后的病毒纯化液蛋白质、血凝素及卵清蛋白含量,计算蛋白质含量与血凝素含量比值及血凝素回收率,确定最佳离心时间。结果确定最佳收峰位置为第三峰,糖度范围为30%~50%之间;当病毒浓缩液进样量为600~700 ml时,30%蔗糖溶液进液量为450~550 ml,55%蔗糖溶液进液量为400~500 ml,转速为90 639×g离心3 h后,可获得最佳纯化效果。结论确定了蔗糖密度梯度离心法纯化流感病毒的最佳工艺参数,为进一步提高流感病毒的纯化效果提供了参考。

关键词：流感病毒蔗糖密度梯度离心纯化

用蔗糖密度梯度离心法检测与定量口蹄疫病毒抗原

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用蔗糖密度梯度离心法检测与定量口蹄疫病毒抗原

蓝隐藻PC645复合物的分离、微观结构及化学稳定化研究

中国畜牧兽医学会生物制品学分会中国微生物学会兽医微生物...

作者：董金杰祁光宇刘学荣乔莉萍安芳兰董文教武发菊陈苗苗常艳燕刘力宽牟克斌黄银君中农威特生物科技股份有限公司中国农业科学院兰州兽医研究所

对细胞培养得到的O型口蹄疫抗原超滤浓缩,用蔗糖密度梯度离心法纯化,采用紫外检测方法检测各梯度区带抗原并收集各吸收峰。通过琼脂扩散沉淀试验做初步鉴定后,进一步用透射电子显微镜确定病毒抗原。结果表明,口蹄疫病毒146S抗原存在于... 详细信息

对细胞培养得到的O型口蹄疫抗原超滤浓缩,用蔗糖密度梯度离心法纯化,采用紫外检测方法检测各梯度区带抗原并收集各吸收峰。通过琼脂扩散沉淀试验做初步鉴定后,进一步用透射电子显微镜确定病毒抗原。结果表明,口蹄疫病毒146S抗原存在于一恒定的梯度区带,此方法解决了口蹄疫抗原检测和定量的最核心技术。

关键词：口蹄疫病毒146S抗原蔗糖密度梯度离心琼脂扩散沉淀电镜检测

来源： cnki会议评论

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cnki会议

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蓝隐藻PC645复合物的分离、微观结构及化学稳定化研究

作者：王静烟台大学

学位级别：硕士

对原有的PC645复合物蔗糖密度梯度离心分离纯化条件进行改进和优化,从蓝隐藻Chroomonas placoidea T13中大规模、稳定分离和基本纯化了目前未曾报道的PC645复合物,由此证明了隐藻藻胆蛋白确实存在天然的聚合形态;对PC复合物的吸收、荧... 详细信息

对原有的PC645复合物蔗糖密度梯度离心分离纯化条件进行改进和优化,从蓝隐藻Chroomonas placoidea T13中大规模、稳定分离和基本纯化了目前未曾报道的PC645复合物,由此证明了隐藻藻胆蛋白确实存在天然的聚合形态;对PC复合物的吸收、荧光、圆二色谱等光谱特性以及等电点、多肽组成等分析证实,其与异二聚体PC645的光谱特性基本相同,为ααββ型异二聚体组成的聚合物,不含实验室前期研究发现的β亚基;所得PC复合物分子量约为240 k Da,但在二次SDGC或低盐(0.05 mol/L PBS)洗脱条件下全部解离为异二聚体。采用交联剂戊二醛、缩合剂EDC未能使PC复合物稳定化,而小分子交联剂甲醛在PC复合物交联反应中更具有可行性;发现交联反应不影响复合物的荧光发射性能,但首先影响PC复合物中与PCBβ色基相关的645 nm吸收峰,其次才是580和625 nm特征峰,说明该色基应位于PC复合物的外侧;反复摸索和初步优化确定甲醛稳定化条件为:甲醛浓度100.14 mg/m L、反应时间6 h、复合物样品A=2.5;研究了交联产物3个月保存期内的光谱变化,并发现其在SDS-PAGE、IEF、SDGC或0.05 mol/L PBS低盐浓度下不完全解离,且对高浓度尿素、SDS等具有较高的耐受性;建立了以PE六聚体和PC645异二聚体为分子量指标的分子筛层析体系,初步确定稳定化后的交联产物分子量为120 k Da,是由两个异二聚体形成的交联产物。实验结果为今后开发化学稳定化的新型隐藻藻胆蛋白荧光探针奠定了基础。在对大量负染透射电镜图片中俯视、侧视和斜视颗粒的统计分析基础上,确定了PC复合物是由4个PC645异二聚体围成的单层中空环状颗粒,外径11～16 nm(平均13.36±2.64 nm),内径2～5 nm(平均3.48±1.52 nm),厚约4～6 nm(平均5±1 nm);此外还观测到中空环状颗粒还可进一步聚合,说明PC复合物可能还有更高一层次的组装形式。在确定PCBβ色基位于PC复合物外侧的前提下,通过Py MOL软件预判了复合物中PC645异二聚体最可能的姿态及其两侧氨基酸分布;采用M-ZDOCK蛋白质对接软件预测了4个PC645参与的多聚体模型,从前10种得分最高的预测模型中筛选出构象极为相近的第6和9种预测姿势,预测姿势6(或9)的参数为:环内径3.32nm(3.55 nm)、外径11.2 nm(11.35 nm)、高6.1 nm(6.24 nm)、凹处高3.3 nm(3.63 nm);两个姿势中,每个异二聚体都以相同的、Py MOL预判的姿态相互结合,彼此只有2个异二聚体有所扭转,且接触面都有3个几乎相同的接触区域,大多为loop和小的螺旋,且富含小的非极性氨基酸;两个姿势中的每个PCBβ色基均处于环的外侧,环状结构外缘平滑,形态与电镜观测结果相符,预测姿势可与电镜图中颗粒图像完全吻合。上述结果说明PC复合物至少存在两种稳定构象,预测姿势6更为致密、紧凑,也更为合理;而预测姿势9则为亚稳结构。由此提出PC复合物的构象具有柔性且不是唯一的观点。研究结果突破了原有的对隐藻藻胆蛋白存在状态的认知,对隐藻光合系统结构、功能和进化研究都将具有重要意义。

关键词：蓝隐藻 PC645复合物蔗糖密度梯度离心化学稳定化复合物结构预测

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正交试验设计优化流感病毒纯化工艺

中国生物制品学杂志 2020年第10期33卷 1201-1205页

作者：郭文军聂飞袁长伍王琳琳李雅军郑杨卢彩刘鹏程孙瑜山西培森生物制品有限公司山西忻州034000 大连雅立峰生物制药有限公司辽宁大连116620

目的通过正交试验优化流感病毒蔗糖密度梯度离心纯化工艺条件。方法以影响流感病毒纯化效果的蔗糖溶液用量、上样量、超速离心时间及上样速度为试验因素,每因素设3个水平,通过正交试验设计9组试验。每组试验流感病毒浓缩液纯化后获得的... 详细信息

目的通过正交试验优化流感病毒蔗糖密度梯度离心纯化工艺条件。方法以影响流感病毒纯化效果的蔗糖溶液用量、上样量、超速离心时间及上样速度为试验因素,每因素设3个水平,通过正交试验设计9组试验。每组试验流感病毒浓缩液纯化后获得的样品进行血凝滴度及蛋白含量检测,计算血凝滴度收率和蛋白去除率;根据正交试验血凝滴度收率、R值及K值结果,确定最适纯化工艺参数。采用最适纯化工艺对中试3批流感病毒浓缩液进行纯化。结果正交试验结果表明,影响流感病毒纯化效果因素的重要性依次为超速离心时间、蔗糖溶液用量、上样量、上样速度,最适纯化工艺参数为超速离心时间3 h,30%蔗糖溶液用量500 mL/台,上样量为700 mL/台,上样速度为60 m L/min。3批中试病毒浓缩液纯化后的血凝滴度收率均>90%,满足工艺需求。结论采用正交试验获得的流感病毒纯化工艺适合于规模化生产。

关键词：正交试验流感病毒纯化蔗糖密度梯度离心

马疱疹病毒1型XJ2015株的增殖、纯化及鉴定

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中国生物制品学杂志 2021年第3期34卷 282-285页

作者：贾钦瑞鲍子磊车传忠郑学功翟少华冉多良新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830052

目的评价蔗糖密度梯度离心法对马疱疹病毒1型(equine herpesvirus-1,EHV-1)XJ2015株的纯化效果。方法病毒增殖后,收获病毒液,经硫酸铵浓缩、蔗糖密度梯度离心法纯化EHV-1,电镜下观察病毒形态,SDS-PAGE、Western blot、BCA及马体致病性... 详细信息

目的评价蔗糖密度梯度离心法对马疱疹病毒1型(equine herpesvirus-1,EHV-1)XJ2015株的纯化效果。方法病毒增殖后,收获病毒液,经硫酸铵浓缩、蔗糖密度梯度离心法纯化EHV-1,电镜下观察病毒形态,SDS-PAGE、Western blot、BCA及马体致病性试验鉴定病毒纯化效果。结果纯化后的EHV-1电镜下可见完整的病毒颗粒且形态典型,直径约120 nm,效价可达10^(10.02) TCID_(50)/0.1 mL,回收率为61.7%;SDS-PAGE及Western blot分析显示,纯化病毒杂蛋白显著减少且具有良好的反应原性;纯化后病毒感染马匹出现原发性感染临床症状并出现排毒现象。结论利用蔗糖密度梯度离心法可获得高纯度的纯化病毒株EHV-1-XJ-2015,为进一步研究EHV-1的致病机理及减毒、灭活疫苗的研发提供了参考。

关键词：马疱疹病毒1型蔗糖密度梯度离心纯化鉴定

喉癌Hep-2细胞来源的exosomes提取方法的比较

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临床耳鼻咽喉头颈外科杂志 2015年第17期29卷 1522-1526页

作者：梁俊毅吉晓滨刘启才谢景华广州市第一人民医院耳鼻咽喉科广州510180 广州医科大学实验医学研究中心

目的:对分离提取喉癌Hep-2细胞来源的exosomes 2种方法进行对比,展现不同方法的优缺点,为选择分离提取包括喉癌Hep-2细胞在内的肿瘤细胞来源exosomes的方法提供参考。方法:大量培养喉癌Hep-2细胞,42℃热休克处理。收集90ml培养上清液,... 详细信息

目的:对分离提取喉癌Hep-2细胞来源的exosomes 2种方法进行对比,展现不同方法的优缺点,为选择分离提取包括喉癌Hep-2细胞在内的肿瘤细胞来源exosomes的方法提供参考。方法:大量培养喉癌Hep-2细胞,42℃热休克处理。收集90ml培养上清液,先通过3/0.8μm深层过滤小型滤芯对上清液进行预处理,去除直径较大的颗粒和杂质,再利用蔗糖密度梯度离心联合超滤离心法,将上清液浓缩提纯;收集培养上清液4ml,依次加入Exosome Isolation Kit内试剂,通过exosomes提取专用过滤柱,收集浓缩液。用高倍透射电子显微镜对2种方法所得的exosomes浓缩液分别鉴定,作出评价。结果:2种方法均能成功地从喉癌Hep-2细胞培养上清液中分离提取出exosomes。单个高倍视野下,蔗糖密度梯度离心联合超滤离心法提取exosomes分散性较好,但密度较低,背景见杂质较多;Exosome Isolation Kit所提取exosomes排列紧密,密度较高,背景杂质较少。结论:2种方法各具特点,均是较理想的exosomes分离提取方法。利用Exosome Isolation Kit分离提取exosomes具有样本量少、提取时间短、步骤简单、产物量大等优点,为喉癌Hep-2来源exosomes的分离提取提供了较好的选择。

关键词： exosomes 蔗糖密度梯度离心超滤离心 exosome Isolation Kit

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结合态PC645组分的分离纯化和性质

烟台大学学报(自然科学与工程版) 2023年

作者：王宇涵任靖文陈敏烟台大学生命科学学院

采用蔗糖密度梯度离心方法从蓝隐藻(Chroomonas placoidea)中分离得到了含有结合态藻蓝蛋白PC645的Chl-蛋白条带Band III；硫酸铵分级沉淀显示，50%硫酸铵可最有效去除其中大部分Chl-蛋白且有效避免PC645的损失。光谱和多肽分析表明，... 详细信息

采用蔗糖密度梯度离心方法从蓝隐藻(Chroomonas placoidea)中分离得到了含有结合态藻蓝蛋白PC645的Chl-蛋白条带Band III；硫酸铵分级沉淀显示，50%硫酸铵可最有效去除其中大部分Chl-蛋白且有效避免PC645的损失。光谱和多肽分析表明，含量最丰富的Band I的β亚基主要为β1型，说明PC645占主导的α1α2β1β1异二聚体形式主要以游离态存在于类囊体腔中；而Band III中富含的β2型亚基参与形成的异二聚体很可能为α1α2β1β2，其疏水性更强，更易于被盐析沉淀。硫酸铵分级沉淀后的Band III经疏水层析得到的疏水程度较低的组分1同时含有PC645和Chl a-蛋白；疏水程度最高的组分4，为基本不含叶绿素的、充分纯化的PC645，且很可能是Band III中与Chl-蛋白处于结合态的PC645组分。结果为今后隐藻两套捕光系统结构和相互作用机制研究奠定了基础。

关键词：蓝隐藻 PC645-Chl-蛋白复合物蔗糖密度梯度离心硫酸铵分级沉淀疏水层析

SGC7901胃癌细胞株中高尔基体的分离及鉴定

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生物医学工程学杂志 2010年第5期27卷 1085-1088页

作者：何婷婷易永芬李艳青肖钟重庆医科大学病理科重庆400016 重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心重庆400016

高尔基体作为主要的分泌细胞器,其功能复杂。从细胞内分离出纯度较高的高尔基体有利于对其功能的深入研究。通过胃癌细胞SGC7901的大量体外培养,差速离心结合蔗糖密度梯度离心法纯化分离出高尔基体后,电镜及中性红超活染色进行形态学鉴... 详细信息

高尔基体作为主要的分泌细胞器,其功能复杂。从细胞内分离出纯度较高的高尔基体有利于对其功能的深入研究。通过胃癌细胞SGC7901的大量体外培养,差速离心结合蔗糖密度梯度离心法纯化分离出高尔基体后,电镜及中性红超活染色进行形态学鉴定,高尔基体标志酶半乳糖基转移酶Galse及硫胺素焦磷酸酶TPPase活性测定进行纯度分析,首次从胃癌细胞SGC7901内成功分离出纯度较高的高尔基体,为对高尔基体功能的深入研究奠定基础。

关键词：高尔基体胃癌细胞亚细胞器分离蔗糖密度梯度离心

H9N2亚型禽流感病毒纯化及病毒HA蛋白定量方法研究

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中国畜牧兽医 2019年第7期46卷 2069-2078页

作者：彭成成吴熠潇刘旭平谭文松华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室

为实现H9N2亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)疫苗上下游过程的控制,本研究结合蔗糖密度梯度离心和SDS-PAGE灰度分析建立了H9N2亚型AIV纯化和病毒HA蛋白定量的方法。首先将收获的病毒原液经差速离心、PEG6000沉淀和蔗糖密度梯... 详细信息

为实现H9N2亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)疫苗上下游过程的控制,本研究结合蔗糖密度梯度离心和SDS-PAGE灰度分析建立了H9N2亚型AIV纯化和病毒HA蛋白定量的方法。首先将收获的病毒原液经差速离心、PEG6000沉淀和蔗糖密度梯度离心分别进行澄清、浓缩和分离纯化;其次,采用改装过的高效液相色谱仪系统(HPLC)准确定位和收集病毒离心区带,并对该区带进行SDS-PAGE和Western blotting分析,同时考察该收集方式的线性和重复性;然后,在此基础上优化病毒液的澄清工艺以提高病毒回收率;最后,观察还原SDS-PAGE分离的H9N2亚型AIV蛋白条带的共迁移情况并确定糖苷酶PNGase F脱糖基处理的最佳条件,采用Image J软件分析SDS-PAGE图谱中4个主要病毒蛋白条带(NP、HA1、M1和HA2)的灰度以确定流感病毒血凝素的含量。结果表明,HPLC收集的病毒离心区带的蛋白浓度与PEG6000浓缩的上清体积在8~32 mL范围内具有良好的线性关系(R^2=0.994),且该收集方式重复性好,批内和批间变异系数分别为1.29%和4.11%。病毒液经过澄清、浓缩和分离纯化后,最终的病毒回收率为79.55%。纯化的H9N2亚型AIV的蛋白浓度为1 000μg/mL时,经糖苷酶PNGase F脱糖基处理后便能得到条带清晰平整且分离良好的SDS-PAGE图谱。经灰度分析,HA含量占总病毒蛋白含量的46.18%。本研究初步建立了H9N2亚型AIV纯化和病毒HA蛋白定量的方法,为H9N2亚型AIV全病毒灭活疫苗的研发和生产提供了简单、准确的检测手段。

关键词： H9N2亚型禽流感病毒血凝素蔗糖密度梯度离心纯化 SDS-PAGE 定量