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湖羊瘤胃微生物GH9家族葡聚糖酶基因IDSGLUC9-25的表达与功能表征

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微生物学报 2024年第3期64卷 755-766页

作者：徐晓锋韩俊彦丁钰杰廖静高德英张骥王佳堃尹尚军王谦徐洁皓浙江万里学院生物与环境学院浙江宁波315100 浙江大学动物科学学院奶业科学研究所浙江杭州310058 杭州云心质力生物科技有限公司浙江杭州310018

【目的】葡聚糖酶是饲用添加剂的重要成分,本研究旨在从湖羊消化道微生物中挖掘性质优良的GH9家族葡聚糖酶基因,用于研发新型饲用酶制剂。【方法】从湖羊瘤胃微生物cDNA中扩增IDSGLUC9-25基因,在大肠杆菌中进行异源表达,对重组蛋白进行... 详细信息

【目的】葡聚糖酶是饲用添加剂的重要成分,本研究旨在从湖羊消化道微生物中挖掘性质优良的GH9家族葡聚糖酶基因,用于研发新型饲用酶制剂。【方法】从湖羊瘤胃微生物cDNA中扩增IDSGLUC9-25基因,在大肠杆菌中进行异源表达,对重组蛋白进行诱导表达和纯化,研究重组蛋白的酶学性质和底物水解模式。【结果】IDSGLUC9-25基因编码527个氨基酸,包含一个CelD_N结构和一个GH9家族催化结构域;重组蛋白rIDSGLUC9-25分子量约为62.7 kDa,最适反应温度和pH分别为40℃和6.0,在30–50℃下活性较高,在pH 4.0–8.0范围内能够保持较高的稳定性,经pH4.0–8.0缓冲液处理1h后残余活性均大于90%;底物谱分析表明,rIDSGLUC9-25能催化大麦β-葡聚糖、苔藓地衣多糖、魔芋胶和木葡聚糖,比活性分别为(443.55±24.48)、(65.56±5.98)、(122.37±2.85)和(159.16±7.73)U/mg;利用薄层色谱法(thinlayer chromatography,TLC)和高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)分析水解产物发现,rIDSGLUC9-25降解大麦葡聚糖主要生成纤维三糖(占总还原糖64.19%±1.19%)和纤维四糖(占总还原糖26.24%±0.12%),催化地衣多糖主要生成纤维三糖(占总还原糖78.46%±0.89%)。【结论】本研究报道了一种来自密螺旋体属细菌的内切β-1,4-葡聚糖酶IDSGLUC9-25(EC3.***.1.4),能高效催化多糖底物生成纤维三糖和纤维四糖,为研发饲用酶制剂和制备低聚寡糖建立基础。

关键词：湖羊消化道微生物葡聚糖酶 IDSGLUC9-25 纤维寡糖

湖羊瘤胃微生物来源的低温葡聚糖酶的表达与功能表征

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浙江大学学报(农业与生命科学版) 2024年

作者：丁钰杰徐晓锋韩俊彦周叶波麻子莹沈桢祎钱国英王佳堃徐洁皓王谦浙江大学动物科学学院奶业科学研究所浙江万里学院生物与环境学院

葡聚糖酶作为添加剂在饲料、食品、纺织工业中具有重要的应用价值。本研究从湖羊瘤胃微生物c DNA中扩增IDSGH5-50基因，通过大肠埃希菌进行异源表达，研究重组蛋白的酶学性质和水解产物。结果表明：IDSGH5-50编码690个氨基酸，蛋白质分... 详细信息

葡聚糖酶作为添加剂在饲料、食品、纺织工业中具有重要的应用价值。本研究从湖羊瘤胃微生物c DNA中扩增IDSGH5-50基因，通过大肠埃希菌进行异源表达，研究重组蛋白的酶学性质和水解产物。结果表明：IDSGH5-50编码690个氨基酸，蛋白质分子量为75.78 kDa，等电点为4.79；重组蛋白r IDSGH5-50的最适反应条件为温度30℃、pH 6.0，在4～20℃保持较高活性（>70%)，在pH 5.0～7.0范围内稳定性较高。底物谱分析显示，rIDSGH5-50能催化大麦β-葡聚糖、苔藓地衣多糖、罗望子木葡聚糖和魔芋胶，比活力分别为（10.42±0.16）、（7.12±0.08）、（7.03±0.38）、（5.94±0.65） U/mg。薄层色谱分析显示，在rIDSGH5-50催化下，大麦葡聚糖主要降解成纤维四糖、五糖，地衣多糖主要降解成纤维三糖、五糖，魔芋胶主要降解成纤维五糖，木葡聚糖主要降解成聚合度>5的寡糖。本研究报道了一种来自瘤胃球菌属的低温β-1,4-内切葡聚糖酶IDSGH5-50(EC 3.***.1.4)，为饲料、食品酶制剂开发奠定了基础。

关键词：湖羊瘤胃葡聚糖酶低温冷适应底物水解

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葡萄几丁质酶和葡聚糖酶基因家族的分析

葡萄几丁质酶和葡聚糖酶基因家族的分析

作者：姚姮河北科技师范学院

学位级别：硕士

本研究以赤霞珠葡萄(Vitis vinifera *** Sauvignon)为材料,运用生物信息学方法,对葡萄几丁质酶(Chitinase-like,CTL)和葡聚糖酶(β-1,3-G lucanase,GLU)的基因家族进行分析。以已有转录组数据为基础,解析了在绿盲蝽(Apolygus lucorum M... 详细信息

本研究以赤霞珠葡萄(Vitis vinifera *** Sauvignon)为材料,运用生物信息学方法,对葡萄几丁质酶(Chitinase-like,CTL)和葡聚糖酶(β-1,3-G lucanase,GLU)的基因家族进行分析。以已有转录组数据为基础,解析了在绿盲蝽(Apolygus lucorum Meyer-Dür.)取食情况下,两种酶的关键基因在赤霞珠葡萄防御反应中的响应,并对在绿盲蝽三龄若虫不同取食条件下的赤霞珠葡萄叶片几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶的活性进行测定。本试验主要研究结果如下:1.通过对葡萄几丁质酶和葡聚糖酶基因组的搜索比对,本研究共鉴定出53个葡萄CTL基因和88个葡萄GLU基因。大致可以将CTL基因分为5类,GLU基因分为3类。不同亚家族几丁质酶基因的内含子和外显子数目存在明显差异,而葡聚糖酶基因除了4个不包含内含子的基因外,其余均包含1～2个内含子。通过对Vv CTLs和Vv GLUs进行蛋白特性分析发现,两个基因家族的氨基酸长度均相差较大。在葡萄的19条染色体中,CTL基因不均匀的分布在8条染色体上,以5号染色体最多,GLU基因则不均匀的分布在16条染色体上,且以6号染色体最多。葡萄CTL基因和GLU基因上游启动子顺式作用元件均分属于光响应、激素响应、植物生长发育和胁迫响应类型。2.通过对绿盲蝽取食诱导赤霞珠葡萄的转录组数据进行比对,筛选出Chitinase基因集共59个基因和Glucanase基因集共53个基因,对这两个基因集进行分析发现,染色体定位和结构域分析结果与基因组分析结果一致。表达量统计发现,表达量大于10的CTL基因有8个,均为上调基因,而GLU基因有9个,其中3个下调基因,6个上调基因。GO和KEGG数据库分析表明,两个基因集在三大功能分类中分别映射到19条和14条GO功能通路,主要涉及的代谢通路为氨基糖和核苷酸糖代谢、MAPK植物信号通路和淀粉和蔗糖代谢途径。结合差异表达基因和蛋白互作网络分析的结果,本研究共筛选出6个CTL差异表达基因和4个高表达GLU基因。3.本研究通过测定不同密度和不同时间下,绿盲蝽三龄若虫取食诱导赤霞珠叶片的几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶的活性发现,随着取食时间的延长和虫害胁迫密度的增加,赤霞珠葡萄叶片内的几丁质酶活性逐渐提高。结果表明在第3d时几丁质酶活性快速升高,表现为显著差异(P葡聚糖酶活性均无显著差异(P>0.05)。随着持续取食时间的延长,绿盲蝽死亡率不断增加,相关性分析表明几丁质酶与绿盲蝽的死亡密切相关。4.本试验对筛选所得10个基因进行引物设计,逆转录得到cDNA,克隆了VIT＿05s0094g00340和VIT＿08s0007g06060基因并分别连接单酶切载体p Cambia2301-JC,经测序目的基因插入载体,表达载体构建准确。综上所述,本研究分析鉴定了葡萄几丁质酶和葡聚糖酶基因家族,解析了赤霞珠葡萄几丁质酶和葡聚糖酶基因在受到绿盲蝽侵害后的代谢响应机制,探究了两种酶活性变化与绿盲蝽死亡的相关性,并对筛选出的关键基因进行克隆。研究结果为进一步验证几丁质酶和葡聚糖酶基因的抗虫特性奠定了基础。

关键词：赤霞珠葡萄几丁质酶葡聚糖酶绿盲蝽

黑曲霉耐热型葡聚糖酶纤维素结合结构域的替换与融合体酶性质

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食品与发酵工业 2024年第5期50卷 14-21页

作者：单逸蓝杨梦莲赵琳沈微杨海泉夏媛媛陈献忠江南大学工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122 安徽华恒生物科技有限公司安徽合肥231131

该文旨在通过更换纤维素结合结构域(cellulose binding domain, CBD)的方式探索获得具有纤维素水解能力的耐热型葡聚糖酶的方法。黑曲霉(Aspergillus niger)来源的葡聚糖酶AnEglA6具有优越的耐热性能,在禽类饲料生产中具有应用前景。通... 详细信息

该文旨在通过更换纤维素结合结构域(cellulose binding domain, CBD)的方式探索获得具有纤维素水解能力的耐热型葡聚糖酶的方法。黑曲霉(Aspergillus niger)来源的葡聚糖酶AnEglA6具有优越的耐热性能,在禽类饲料生产中具有应用前景。通过更换不同家族来源的碳水化合物结合结构域(carbohydrate binding module, CBM)编码区,构建了融合体葡聚糖酶基因,分别在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中进行异源表达。AnEglA6催化结构域与分别来源于嗜热菌(Caldicellulosiruptor kristjanssonii)和荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的木聚糖酶的底物结合结构域CBM9、CBM10结合获得的融合体酶AnEg-CBM9和AnEg-CBM10均具有较高的纤维素水解能力,并且底物范围进一步扩大,对微晶纤维素也具有一定的水解能力。AnEg-CBM10热稳定性有显著的提高,在85℃下酶活力半衰期达到40 min左右,能短时耐受90℃高温。融合体酶AnEg-CBM10是一种热稳定性提高、具有纤维素水解能力的新型葡聚糖酶。

关键词：葡聚糖酶热稳定性底物结合结构域 CBM9 CBM10

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吡咯伯克霍尔德氏菌B1213产葡聚糖酶条件的优化

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中国食品学报 2023年第4期23卷 168-180页

作者：魏莱程睿文王富强徐一人马景浩崔梓豪马艳莉徐江琪田进英范光森北京工商大学食品与健康学院北京100048 北京工商大学、北京市食品添加剂工程技术研究中心北京100048 南阳理工学院、河南省工业微生物资源与发酵技术重点实验室河南南阳473004 北京工商大学食品风味化学北京市重点实验室北京100048

以吡咯伯克霍尔德氏菌B1213为研究对象,优化其发酵产葡聚糖酶条件。首先,通过单因素实验对其培养条件(碳源种类、碳源粒度、碳源质量浓度、氮源种类、氮源质量浓度、转速、温度、装液量、接种量、初始pH值、表面活性剂种类、表面活性剂... 详细信息

以吡咯伯克霍尔德氏菌B1213为研究对象,优化其发酵产葡聚糖酶条件。首先,通过单因素实验对其培养条件(碳源种类、碳源粒度、碳源质量浓度、氮源种类、氮源质量浓度、转速、温度、装液量、接种量、初始pH值、表面活性剂种类、表面活性剂质量浓度和时间)进行初步优化,然后通过Plackett-Burman试验,筛选出4个显著影响B1213产葡聚糖酶的因素,再利用最陡爬坡试验确定其产葡聚糖酶的最大响应区域,最后通过Box-Behnken试验设计确定其最优产葡聚糖酶条件为:40~60目麦麸质量浓度50 g/L,酵母浸粉质量浓度8 g/L,初始pH 6.6,装液量30 mL/250 mL,接种量0.15%,曲拉通100质量浓度25 g/L,温度30℃,转速160 r/min和培养时间83 h。在此培养条件下B1213产葡聚糖酶活力达到1230 U/mL。研究结果为细菌B1213在白酒酿造中的应用提供理论基础。

关键词：吡咯伯克霍尔德氏菌葡聚糖酶响应面法发酵条件麦麸

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葡聚糖酶在甘蔗混合汁澄清中的应用

食品工业科技 2012年第9期33卷 175-180页

作者：贺湘赵振刚于淑娟平野淳也华南理工大学轻工与食品学院广东广州510640 阿玛诺天野酶制剂商贸(上海)有限公司上海200040

制糖工业中葡聚糖给生产带来严重危害。利用葡聚糖酶降解甘蔗糖厂混合汁中的葡聚糖。首先监测混合汁在自然静置下葡聚糖含量、过滤速度等指标的变化。其次在不同条件(酶剂量、pH、温度及酶解时间)下对葡聚糖酶的降解作用进行研究,得到... 详细信息

制糖工业中葡聚糖给生产带来严重危害。利用葡聚糖酶降解甘蔗糖厂混合汁中的葡聚糖。首先监测混合汁在自然静置下葡聚糖含量、过滤速度等指标的变化。其次在不同条件(酶剂量、pH、温度及酶解时间)下对葡聚糖酶的降解作用进行研究,得到此葡聚糖酶的最佳降解范围为:酶剂量10～15mg/kg,酶解pH5.0～6.0,酶解温度50～65℃,酶解时间10～15min。在酶解的最佳范围内模拟糖厂实际生产流程进行实验验证,加入10mg/kg葡聚糖酶,清汁中葡聚糖含量降低了61.32%,沉降时间减少了13.46%,简纯度提高了0.65%,而pH、锤度无明显变化。

关键词：葡聚糖酶混合汁葡聚糖过滤速度

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葡聚糖酶应用于甘蔗混合汁的工艺优化

食品工业科技 2012年第4期33卷 330-335页

作者：贺湘赵振刚于淑娟平野淳也华南理工大学轻工与食品学院广东广州510640 阿玛诺天野酶制剂商贸(上海)有限公司上海200040

制糖过程葡聚糖的存在不仅造成蔗糖损失,其高粘性也给生产带来严重的影响。利用响应面法(RSM)对葡聚糖酶降解糖厂混合汁中的葡聚糖进行了工艺优化。基于单因素实验,以葡聚糖酶剂量(mg/kg)、酶解pH、酶解温度(℃)、酶解时间(min)为响应因... 详细信息

制糖过程葡聚糖的存在不仅造成蔗糖损失,其高粘性也给生产带来严重的影响。利用响应面法(RSM)对葡聚糖酶降解糖厂混合汁中的葡聚糖进行了工艺优化。基于单因素实验,以葡聚糖酶剂量(mg/kg)、酶解pH、酶解温度(℃)、酶解时间(min)为响应因子,混合汁中葡聚糖含量为响应值,作四因素三水平响应面分析,得到酶解的最优工艺条件。结合糖厂实际生产,提出可供糖厂应用葡聚糖酶降解葡聚糖的参考工艺条件:葡聚糖酶剂量10～15mg/kg蔗汁,反应时间10～15min,反应pH为4.5～5.5(最优为4.90),反应温度为50～60℃(最优为54.3℃)。在此工艺范围内,得到混合汁中的葡聚糖含量为313～354mg/kg·Brix,对应其去除率为74.45%～71.10%。

关键词：响应面法葡聚糖酶甘蔗混合汁葡聚糖

利用乳酸乳球菌AcmA表面展示β-1,3-1,4-葡聚糖酶

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生物工程学报 2009年第1期25卷 89-94页

作者：李小华黄新凤邵小虎李林华中农业大学农业微生物学国家重点实验室武汉430070

采用PCR扩增乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)MB191菌株的全长肽聚糖水解酶基因acmA,通过C-末端融合构建了与绿色荧光基因gfp的融合基因acmA-gfp,再连接于表达载体pMG36k上后得到可组成型表达AcmA-GFP融合蛋白的重组质粒pMB137,然后将该... 详细信息

采用PCR扩增乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)MB191菌株的全长肽聚糖水解酶基因acmA,通过C-末端融合构建了与绿色荧光基因gfp的融合基因acmA-gfp,再连接于表达载体pMG36k上后得到可组成型表达AcmA-GFP融合蛋白的重组质粒pMB137,然后将该质粒电转化导入到乳酸乳球菌AS1.2829中获得重组菌MB137。经SDS-PAGE检测,重组菌MB137可表达预期的分子量约74kD的蛋白质。Western blotting、细胞分级分离组分的荧光活性测定和特异GFP二抗标记的流式细胞仪检测证实GFP被成功锚定在重组菌细胞表面,被锚定蛋白约占总表达融合蛋白的35%。进一步通过从枯草芽胞杆菌BF7658基因组中扩增去信号肽序列的β-1,3-1,4葡聚糖酶基因gls,来取代pMB137中的gfp,得到携带融合基因acmA-gls的重组质粒pMB138,经导入到乳酸乳球菌AS1.2829后得到重组菌MB138,其全细胞β-1,3-1,4-葡聚糖水解酶的活性约为12U/mL菌液,明显高于对照菌株。

关键词：细胞表面展示 N-乙酰胞壁质酶葡聚糖酶全细胞催化剂

葡聚糖酶17QT Thumb结构中底物特异性关键氨基酸的研究

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葡聚糖酶17QT Thumb结构中底物特异性关键氨基酸的研究

作者：黄亚威河南农业大学

学位级别：硕士

课题组前期在GH12家族葡聚糖酶Cel12B中入GH11家族酶的Thumb结构,获得突变体酶17QT,很好的保留了GH12家族酶的热稳定性,对木聚糖底物水解产生的木二糖、木三糖和木四糖含量增加,但17QT对CMC(羧甲基纤维素钠盐)和BWX(山毛榉木聚糖)两种... 详细信息

课题组前期在GH12家族葡聚糖酶Cel12B中入GH11家族酶的Thumb结构,获得突变体酶17QT,很好的保留了GH12家族酶的热稳定性,对木聚糖底物水解产生的木二糖、木三糖和木四糖含量增加,但17QT对CMC(羧甲基纤维素钠盐)和BWX(山毛榉木聚糖)两种底物的亲和能力和酶的催化能力下降。由于构建的17QT的Thumb结构来源于中低温黒曲霉,而17QT在100℃条件下仍有很好的稳定性,高温条件下可能不适于中低温来源的Thumb结构行使功能。本研究通过对GH11家族Thumb结构的筛选比对,并进行Thumb结构的氨基酸定点突变,探究对Thumb降解木聚糖底物的关键氨基酸位点。对17QT中Thumb中确定的关键氨基酸位点进行单点突变和多点组合突变,获得葡聚糖酶对木聚糖底物亲和、水解能力提高。从嗜热菌来源酶的Thumb结构氨基酸序列比对,依据Thumb结构序列的高度保守性,确定Thumb结构上三个突变位点和与Thumb末尾连接处突变位点。在GH11家族木聚糖酶23A2的Thumb结构进行氨基酸单点突变,构建了4个突变体E119Q、T123E、S126T、T129D。在葡聚糖酶17QT中对Thumb结构上三个突变位点进行单点突变和多点组合突变,构建了7个突变体E177Q、T181E、S184T、E177Q-T181E、T181E-S184T、E177Q-S184T和三点突变。对Thumb结构突变体酶学性质检测结果如下:木聚糖酶Thumb结构突变体纯酶性质检测(1)突变体E119Q、T123E、S126T、T129D最适p H为4.2、4.0、4.0、4.4,相对于23A2最适p H3.8由酸性趋向中性。(2)最适温度检测中,23A2最适温度为50℃,突变体E119Q、T123E、T129D的最适温度都为50℃,这三个点的突变对酶对最适温度无明显影响,而S126T的最适温度为45℃,最适的温度的降低,表明该突变会对酶的温度适应性有影响。(3)在50℃条件下,23A2、E119Q、T123E、S126T、T129D的半失活时间依次是23.1min、15.4 min、6.3 min、7.0 min、9.3 min,半衰期检测显示点突变后酶半衰期变短。(4)酶促动力学检测中,反应速度最快的是T129D,V为10.3μmol·L·s是23A2的1.48倍。与23A2的K3.4相比,突变体E119Q、T123E、T129D对底物亲和能力都有所提高,K值依次为3.0、2.9、3.3,底物亲和力最高的是T123E,是23A2的1.167倍。证明Thumb这些位点的突变可以提高对木聚糖底物亲和力。葡聚糖酶Thumb结构突变体粗酶性质检测(1)7个突变体粗酶最适p H和温度检测时与17QT粗酶结果一致,最适p H都为6.0,最适反应温度都为100℃。在100℃条件下检测粗酶半失活时间,E177Q、T181E、S184T、E177Q-T181E、T181E-S184T、E177Q-S184T、三点全突变半失活时间依次为58 min、54 min、33 min、214 min、81 min、82 min、150 min,对比17QT粗酶检测在100℃的半失时间为65min,由此可见突变体与17QT在粗酶半失活时间相比,突变体很好的保留了原有葡聚糖酶的p H广泛性和良好的热稳定性,而且而双点和三点突变后,粗酶半失活时间长于17QT,表现出更好的的热稳定性。(2)在突变体对CMC和BWX底物活性比较中发现,单点突变体底物活性与17QT接近,双点和三点全突变体粗酶检测活性的OD,CMC底物活性明显降低,OD由高于0.4降至低于0.1,由单点突变中高于BWX,变为低于BWX。双点和三点全突变体中,CMC底物活性明显降低,BWX/CMC活性的相对值增大了5至7倍,对BWX底物活性增强。(3)在突变体粗酶的相对比活中发现,单点突变体中,比活最高的是T181E,双点突变体中E177Q-T181E、T181E-S184T突变活性活性无明显增加,T181E-S184T突变体比活降低,三点突变是所有相对比活最高的。由此可见,单点突变体在活性显示与17QT相近的性质,多点组合突变,在具有17QT的良好热稳定性上,对木聚糖底物的亲和降解能力得到提升。在Thumb结构三个氨基酸位点中,三个位点对葡聚糖降解木聚糖底物起着关键作用,它们的组合突变更利于发挥Thumb结构提高对木聚糖底物的亲和与水解能力,三个不同位置的氨基酸突变位点之间存在一定的叠加增益能力,突变体在进行多点组合突变后对于CMC和BWX水解能力发生改变,更利于提高木聚糖底物亲和降解能力。本研究通过对GH11家族木聚糖酶特异性元件Thumb结构中关键氨基酸的突变,葡聚糖酶获得对木聚糖底物亲和、水解能力的提高,为对葡聚糖酶

关键词： Thumb结构木聚糖酶葡聚糖酶关键氨基酸突变