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基于萤火虫生物发光原理的成像探针及抑制剂的研究

基于萤火虫生物发光原理的成像探针及抑制剂的研究

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作者：张华腾山东大学

学位级别：硕士

生物发光(bioluminescence)是存在于生物体内的一种特殊类型的发光现象,主要指在酶的催化作用下将生物能转化成光能的过程,而不依赖于有机体对光的吸收。由于生物发光成像技术具有非侵袭性、可定量、高灵敏度、操作简单、以及能够实时... 详细信息

生物发光(bioluminescence)是存在于生物体内的一种特殊类型的发光现象,主要指在酶的催化作用下将生物能转化成光能的过程,而不依赖于有机体对光的吸收。由于生物发光成像技术具有非侵袭性、可定量、高灵敏度、操作简单、以及能够实时及连续动态监测等优点,其被广泛应用于生物医学研究等领域。生物发光现象普遍存在于自然界的生物体中,例如细菌、昆虫和一些海洋生物等。其中研究最为透彻、应用最为广泛的生物发光体系是萤火虫萤光素酶发光体系。在氧气、ATP和镁离子等存在的前提下,萤火虫萤光素酶氧化底物萤光素,生成氧化萤光素,发出黄绿色的光,波长在600 nm左右。另一个有广泛应用的萤光素酶是海肾萤光素酶,它能够在氧气的催在下,氧化底物腔肠萤光素,释放出淡蓝色的光,波长在480 nm左右。最近发现了结合萤火虫萤光素酶检测和海肾萤光素酶检测的双萤光素酶报告基因技术,可以减小实验误差,使得检测结果更为准确。本论文设计评价了三个用于检测硝基还原酶的生物发光探针;设计并评价了了一批查尔酮类的萤火虫萤光素酶抑制剂;探索了离子化合物作为小分子萤火虫萤光素酶抑制剂在双萤光素酶报告基因技术中的应用。本论文主要包括三部分：1.对3个用于检测硝基还原酶的生物发光探针进行了研究,系统评价了其在酶水平、细胞水平及动物水平的生物活性。硝基还原酶在NADPH或NADH电子供体存在下,可将硝基化合物还原为相应的氨基化合物。肿瘤缺氧是实体肿瘤发生、发展过程中常见的现象,其缺氧程度与硝基还原酶的含量直接相关。本研究发现一个探针具有良好的选择性和灵敏度,最低检测限低至1 ng/mL,动物水平的实验也表明,该探针能够识别不同发展程度的肿瘤,实现对硝基还原酶的可视化检测,是很有潜力的生物发光探针。2.设计合成了一批含有羧基的查尔酮类化合物,在体外和体内对萤火虫萤光素酶的抑制活性进行了评价。由于查尔酮分子的结构具有较大柔性,能与多种靶点相结合,因此呈现出广泛的生物活性。之前的研究发现含羧基的查尔酮类化合物对萤火虫萤光素酶有较强的抑制活性,因此在应用萤火虫萤光素酶作为报告基因的高通量筛选时,容易导致“假阳性”结果的产生。本研究发现最好的羧基查尔酮类化合物IC50值可达到0.69μM。这些羧基查尔酮化合物不仅可以提醒科研工作者们注意可能存在的“假阳性”结果,而且可以深入了解萤火虫萤光素酶/萤光素发光体系,扩大它的应用范围。3.通过模拟双萤光素酶报告基因检测实验,在酶水平和细胞水平评价了22种离子化合物对萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶的抑制活性。在双萤光素酶报告基因检测过程中,需要加入一种具有选择性的生物发光淬灭剂,对萤火虫萤光素酶的生物发光进行快速淬灭,而对海肾萤光素酶的生物发光没有影响。本研究发现NaSCN、KI、Na2S2O3、NaN3等离子化合物能够快速淬灭萤火虫萤光素酶的生物发光,并且基本不影响海肾萤光素酶的生物发光。因此,这些离子化合物有望成为新型的生物发光淬灭剂使用,进而构建出一种非侵袭性的简单实用的双萤光素报告基因检测方法。

关键词：生物发光硝基还原酶探针萤火虫萤光素酶抑制剂查尔酮离子化合物

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萤火虫生物发光的抑制剂研究

萤火虫生物发光的抑制剂研究

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作者：白海秀山东大学

学位级别：硕士

生物发光是生物体内,通过酶催化的化学反应,产生、发射出可见光的过程。这种现象普遍存在于海洋脊椎动物和无脊椎动物,以及一些昆虫、真菌、微生物和陆生无脊椎动物中。生物发光是一种特殊类型的化学发光,它能够把化学能转化成光能,转... 详细信息

生物发光是生物体内,通过酶催化的化学反应,产生、发射出可见光的过程。这种现象普遍存在于海洋脊椎动物和无脊椎动物,以及一些昆虫、真菌、微生物和陆生无脊椎动物中。生物发光是一种特殊类型的化学发光,它能够把化学能转化成光能,转化效率接近100%。并且,这个转变过程不需要依赖于有机体对光的吸收。生物发光作为一种特殊类型的化学发光,因其发光效率高,可视性及灵敏度高,并且具有非侵袭性(non-invasive)的特点,已被广泛应用于基础研究及生命科学研究的各个领域,例如通过生物发光成像(BLI, Bioluminescence imaging)来跟踪有机体基因的表达、建立生物传感器检测环境中特定物质的变化、以及实现有机体内部的生命过程的非损伤性实时监测等等。生物发光体系中研究最为透彻的是萤火虫萤光素酶/萤光素体系。相较于其它生物发光体系,萤火虫萤光素酶/萤光素体系具有发光稳定、强度强、波长长、穿透性强、底物稳定等优势。然而,由于小分子萤火虫萤光素酶抑制剂的存在,该体系在实际应用于高通量筛选时容易导致“假阳性”的出现,这也为药物化学工作者造成了极大地误导。本论文基于萤火虫萤光素酶抑制剂的研究进展,设计并优化了羧基查尔酮类萤火虫萤光素酶抑制剂,并且对2-萘联苯类萤火虫萤光素酶抑制剂以及三氮唑类萤火虫萤光素酶抑制剂进行了酶水平、细胞水平以及动物水平的活性评价。本论文还初步探索了小分子萤火虫萤光素酶抑制剂在生物发光体系中的应用。本论文主要包括三部分：1.合成了一系列羧基查尔酮类衍生物,对其抑制萤火虫萤光素酶的生物活性进行了酶水平、细胞水平及动物水平的评价,并且进一步探索了羧基查尔酮类衍生物抑制萤火虫萤光素酶的抑制模型。由于查尔酮的结构柔性较大,与很多的靶点的活性位点都能够结合,因此查尔酮类化合物具有广泛的生物活性,在高通量筛选的初期经常展现出比较好的活性。然而,真正能走向临床成为候选药物的查尔酮类化合物却非常少。本论文设计合成的羧基查尔酮类衍生物,对萤火虫萤光素酶的抑制活性达到了0.20μM,并且对于萤火虫萤光素酶体系的生物发光表现出了迅速有效的淬灭作用。因此,该类化合物不仅可以警示科研工作者们注意“假阳性”的存在,还有望应用于双萤光素酶报告基因检测体系中,扩大生物发光体系的应用前景。2.对一批2-苯基萘结构的萤火虫萤光素酶抑制剂进行了体内、外活性评价。本研究发现了5个活性较好的2-苯基萘结构的小分子萤火虫萤光素酶抑制剂,对于拓展生物发光体系的应用以及进一步研究萤火虫萤光素酶的发光机制有重要作用。其中,活性最好的化合物2在酶水平抑制的IC50为0.13μM,并且在转基因鼠抑制实验中展现了全身性的抑制作用。本文还通过酶和底物的动力学实验,对该结构化合物的抑制机制进行了初步探索。3.对一批三氮唑类结构的萤火虫萤光素酶抑制剂进行了体内、外活性评价;并对三氮唑类化合物产生萤火虫萤光素酶抑制作用的机制进行了初步探索。其中,活性最好的化合物1a在细胞水平的IC50为3.28μM。本研究发现了一批在体内外均对萤火虫萤光素酶有抑制作用的三氮唑类化合物,旨在警示科研工作者们在研究三氮唑类化合物是及早发现、预防“假阳性”。

关键词：萤火虫萤光素酶抑制剂高通量筛选查尔酮三氮唑 2-苯基萘

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