基于萤火虫生物发光原理的成像探针及抑制剂的研究

作     者：张华腾 

作者单位：山东大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李敏勇

授予年度：2016年

学科分类：0831[工学-生物医学工程（可授工学、理学、医学学位）] 08[工学] 0836[工学-生物工程] 

主      题：生物发光 硝基还原酶探针 萤火虫萤光素酶抑制剂 查尔酮 离子化合物 

摘      要：生物发光(bioluminescence)是存在于生物体内的一种特殊类型的发光现象,主要指在酶的催化作用下将生物能转化成光能的过程,而不依赖于有机体对光的吸收。由于生物发光成像技术具有非侵袭性、可定量、高灵敏度、操作简单、以及能够实时及连续动态监测等优点,其被广泛应用于生物医学研究等领域。生物发光现象普遍存在于自然界的生物体中,例如细菌、昆虫和一些海洋生物等。其中研究最为透彻、应用最为广泛的生物发光体系是萤火虫萤光素酶发光体系。在氧气、ATP和镁离子等存在的前提下,萤火虫萤光素酶氧化底物萤光素,生成氧化萤光素,发出黄绿色的光,波长在600 nm左右。另一个有广泛应用的萤光素酶是海肾萤光素酶,它能够在氧气的催在下,氧化底物腔肠萤光素,释放出淡蓝色的光,波长在480 nm左右。最近发现了结合萤火虫萤光素酶检测和海肾萤光素酶检测的双萤光素酶报告基因技术,可以减小实验误差,使得检测结果更为准确。本论文设计评价了三个用于检测硝基还原酶的生物发光探针;设计并评价了了一批查尔酮类的萤火虫萤光素酶抑制剂;探索了离子化合物作为小分子萤火虫萤光素酶抑制剂在双萤光素酶报告基因技术中的应用。本论文主要包括三部分：1.对3个用于检测硝基还原酶的生物发光探针进行了研究,系统评价了其在酶水平、细胞水平及动物水平的生物活性。硝基还原酶在NADPH或NADH电子供体存在下,可将硝基化合物还原为相应的氨基化合物。肿瘤缺氧是实体肿瘤发生、发展过程中常见的现象,其缺氧程度与硝基还原酶的含量直接相关。本研究发现一个探针具有良好的选择性和灵敏度,最低检测限低至1 ng/mL,动物水平的实验也表明,该探针能够识别不同发展程度的肿瘤,实现对硝基还原酶的可视化检测,是很有潜力的生物发光探针。2.设计合成了一批含有羧基的查尔酮类化合物,在体外和体内对萤火虫萤光素酶的抑制活性进行了评价。由于查尔酮分子的结构具有较大柔性,能与多种靶点相结合,因此呈现出广泛的生物活性。之前的研究发现含羧基的查尔酮类化合物对萤火虫萤光素酶有较强的抑制活性,因此在应用萤火虫萤光素酶作为报告基因的高通量筛选时,容易导致“假阳性结果的产生。本研究发现最好的羧基查尔酮类化合物IC50值可达到0.69μM。这些羧基查尔酮化合物不仅可以提醒科研工作者们注意可能存在的“假阳性结果,而且可以深入了解萤火虫萤光素酶/萤光素发光体系,扩大它的应用范围。3.通过模拟双萤光素酶报告基因检测实验,在酶水平和细胞水平评价了22种离子化合物对萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶的抑制活性。在双萤光素酶报告基因检测过程中,需要加入一种具有选择性的生物发光淬灭剂,对萤火虫萤光素酶的生物发光进行快速淬灭,而对海肾萤光素酶的生物发光没有影响。本研究发现NaSCN、KI、Na2S2O3、NaN3等离子化合物能够快速淬灭萤火虫萤光素酶的生物发光,并且基本不影响海肾萤光素酶的生物发光。因此,这些离子化合物有望成为新型的生物发光淬灭剂使用,进而构建出一种非侵袭性的简单实用的双萤光素报告基因检测方法。