检索结果-南通市图书馆

基于蛋白质保留膨胀显微镜对微囊泡进行荧光成像的实验研究

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

口腔生物医学 2024年第1期15卷 12-20页

作者：穆视函张凯超金钫隋秉东何奕德金岩雷啸空军军医大学基础医学院陕西西安710032 口颌系统重建与再生全国重点实验室国家口腔疾病临床医学研究中心陕西省口腔疾病国际联合研究中心空军军医大学第三附属医院组织工程研发中心陕西西安710032 口颌系统重建与再生全国重点实验室国家口腔疾病临床医学研究中心陕西省口腔疾病临床医学研究中心空军军医大学第三附属医院正畸科陕西西安710032 口颌系统重建与再生全国重点实验室国家口腔疾病临床医学研究中心陕西省口腔医学重点实验室空军军医大学第三附属医院牙体牙髓病科陕西西安710032

目的:探讨蛋白质保留膨胀显微镜(proExM)与小鼠下颌骨来源微囊泡(MVs)的相容性,观察膨胀后MVs表面标志物的分布情况并精确识别其细胞来源。方法:采用差速离心法分离小鼠下颌骨来源MVs;利用透射电子显微镜、Western blot、纳米颗粒跟踪... 详细信息

目的:探讨蛋白质保留膨胀显微镜(proExM)与小鼠下颌骨来源微囊泡(MVs)的相容性,观察膨胀后MVs表面标志物的分布情况并精确识别其细胞来源。方法:采用差速离心法分离小鼠下颌骨来源MVs;利用透射电子显微镜、Western blot、纳米颗粒跟踪分析技术对MVs进行观察鉴定;对MVs表面蛋白CD9、CD63、碱性磷酸酶(ALP)、破骨细胞相关受体(OSCAR)进行免疫荧光染色;采用proExM技术对免疫荧光染色后的MVs进行膨胀放大;测量膨胀系数并利用激光共聚焦显微镜观察膨胀前后MVs的形态以及荧光染色情况。结果:差速离心法分离得到的小鼠下颌骨来源MVs符合MVs鉴定标准;在该实验流程下,通过凝胶的膨胀实现小鼠下颌骨来源MVs的4倍膨胀;膨胀后MVs线剖面上CD9、CD63的荧光强度分布呈现多峰;相较于膨胀前,膨胀后MVs表面标志物CD9、CD63的曼德斯共定位系数(MCC)1方差变大(P<0.01),MCC2方差变小(P<0.05),皮尔森相关系数(PCC)方差变大(P<0.01);膨胀后实现对成骨细胞分泌的MVs以及破骨细胞分泌的MVs的精准识别;膨胀后测得小鼠下颌骨来源CD9+MVs中,成骨细胞来源MVs占比11.11%,破骨细胞来源MVs占比3.70%。结论:该实验流程可在小鼠下颌骨来源MVs的观测中提高分辨率,为揭示MVs表面蛋白分布的异质性,精准识别组织MVs的细胞来源建立一种标准实验流程。

关键词：蛋白质保留膨胀显微镜微囊泡表面标志物荧光共定位单囊泡分析

羊痘病毒荧光定量PCR检测方法的建立及其毒力因子KLP1与Notch1的互作验证

维普期刊数据库

同方期刊数据库评论

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

羊痘病毒荧光定量PCR检测方法的建立及其毒力因子KLP1与Notch1的...

作者：赵垚鑫塔里木大学

学位级别：硕士

羊痘是由羊痘病毒感染引起的一种使患病动物产生高热、皮疹、呼吸困难等症状,导致生产力下降、死亡率增加的急性、热性、接触性传染病。羊痘病毒主要是通过接触感染动物的体液、分泌物、皮肤等方式传播。成年动物感染后病情通常较轻,幼... 详细信息

羊痘是由羊痘病毒感染引起的一种使患病动物产生高热、皮疹、呼吸困难等症状,导致生产力下降、死亡率增加的急性、热性、接触性传染病。羊痘病毒主要是通过接触感染动物的体液、分泌物、皮肤等方式传播。成年动物感染后病情通常较轻,幼年动物的症状比成年动物严重,死亡率高达100%,严重的阻碍了养羊业的发展。对于羊痘可以通过临床症状表现做出初步诊断,但是要确诊必须通过实验室检测方法完成。因此快速准确检测羊痘病毒的方法对快速控制和扑灭疫情意义重大。研究发现羊痘病毒毒力因子KLP1在羊痘病毒的复制和感染过程中发挥重要作用。本研究以KLP1为目标基因建立羊痘快速诊断的荧光定量PCR方法,同时对本实验室前期通过酵母双杂交的方法筛选出KLP1的宿主互作候选蛋白Notch1进行验证。为羊痘诊断方法建立和羊痘病毒毒力因子KLP1作用机制了解奠定基础。本研究通过设计羊痘病毒毒力因子KLP1全长的引物,构建羊痘病毒毒力因子KLP1的标准品质粒p ET-42b-KLP1。设计基于染料法的实时荧光定量PCR检测方法的特异性引物,构建标准曲线,测定该方法的特异性、敏感性、重复性及临床样品检测。发现此方法的线性关系良好,R为0.99,具有高度的特异性和良好的敏感性,可以检测羊痘病毒达到33.8拷贝/μL的浓度。此外本研究重复性良好,组间变异系数在0.703-0.935%之间,组内变异系数在0.304-0.501%之间,已成功应用于临床样本检测,本研究成功地建立了羊痘病毒的实时定量PCR检测方法,为实验室对临床样本进行检测奠定了基础。本实验室前期已筛选出宿主蛋白Notch1可能是KLP1的互作蛋白,为了验证羊痘病毒毒力因子KLP1与Notch1的互作关系,本研究通过Snap Gene软件设计扩增羊痘病毒毒力因子KLP1与Notch1全长的引物,构建KLP1含RFP标签的真核载体p Ds Red-N1-KLP1和Notch1含GFP标签的真核载体p EGFP-N1-Notch1。将两种重组质粒转染到293T细胞内之后,经观察发现Notch1出现绿色荧光,KLP1出现红色荧光,当它们二者结合后出现黄色荧光,通过Image J软件分析,其散点图显示一条斜率为1的趋势线,两种颜色的荧光呈1:1的共定位关系,两个蛋白的皮尔森相关系数为0.96137198,重叠系数为0.96159702,曼德斯共定位系数的M1为0.86386495、M2为0.97184196。表明KLP1与Notch1蛋白之间存在共定位现象,KLP1与Notch1蛋白之间存在相互作用。综上所述,本研究成功建立了基于羊痘病毒毒力因子KLP1的荧光定量PCR检测方法,为羊痘病毒的实验室检测提供有效的检测工具。并验证了羊痘毒力因子KLP1与Notch1的互作关系,为羊痘防制策略的制定和疫苗的研究提供研究基础。

关键词：羊痘病毒荧光定量PCR KLP1基因荧光共定位

BLM解旋酶与LMNA蛋白相互作用的鉴定及验证

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

基因组学与应用生物学 2021年第11期40卷 3729-3736页

作者：阮涌嵇辛勤许厚强贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室贵阳550025 贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室贵阳550025 贵州大学动物科学学院贵阳550025 贵州大学医学院贵阳550025

布卢姆(Bloom,BLM)解旋酶是一种多功能蛋白,其与多种蛋白共同参与前列腺癌的发生发展过程,因此对该蛋白研究有助于解析其在前列腺癌发生和发展等过程中的作用机制。实验以前列腺癌PC3细胞为研究对象,应用免疫共沉淀(Co-IP)联合质谱鉴定... 详细信息

布卢姆(Bloom,BLM)解旋酶是一种多功能蛋白,其与多种蛋白共同参与前列腺癌的发生发展过程,因此对该蛋白研究有助于解析其在前列腺癌发生和发展等过程中的作用机制。实验以前列腺癌PC3细胞为研究对象,应用免疫共沉淀(Co-IP)联合质谱鉴定和生物信息学分析的方法,鉴定与BLM解旋酶存在相互作用的蛋白,以及其相互作用蛋白与BLM解旋酶在前列腺癌中的相关性,初步筛选确认核纤层蛋白A/C(Lamin A/C,LMNA)具有重要研究价值,并在此基础上进行反向Co-IP和间接免疫荧光试验验证。研究结果证实BLM解旋酶与LMNA存在相互作用。BLM解旋酶与LMNA蛋白互作的确定对研究调控前列腺癌细胞增殖和迁移等奠定了基础。

关键词： BLM解旋酶核纤层蛋白A/C 免疫共沉淀质谱检测荧光共定位

维普期刊数据库

同方期刊数据库评论

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

人CREB4转核机制的初步研究

华东师范大学学报（自然科学版） 2007年第2期 104-110页

作者：刘永强倪晓华周丹王鑫郭伟伟华东师范大学生命科学学院上海200062

cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response element-binding proteins,CREB)是一个哺乳动物转录因子家族,通过cAMP反应元件(cAMP response element,CRE)调节cAMP和钙离子依赖性基因的表达.CREB4是CREB转录因子家族的一员.经酵母双杂交筛选人胎脑文库发现CREB4215-279aa可能与核转运因子kayopherinα2相互作用,提示karyopherinα2可能参与CREB4的跨膜转运过程.亚细胞定位结果显示,CREB4全长定位于细胞质,而缺失C端假定转膜结构域的CREB41-279aa蛋白则转移至细胞核内.荧光共定位进一步显示,CREB4和karyopherinα2共定位于细胞质中,CREB41-279aa和karyopherinα2共定位于细胞核中.结果提示C端被切除之后,CREB4被karyopherinα2转运到核内发挥转录作用.

关键词： CREB4 酵母双杂交荧光共定位 kayopherina2

微小隐孢子虫MEDLE家族成员蛋白的表达与功能验证

维普期刊数据库

同方期刊数据库评论

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

微小隐孢子虫MEDLE家族成员蛋白的表达与功能验证

作者：李宝玲华东理工大学

学位级别：硕士

隐孢子虫(Cryptosporidium)是感染人、反刍动物和其它哺乳动物的重要病原,可引起人兽共患的隐孢子虫病。课题组前期利用比较基因组学分析方法,通过对两个遗传相近(基因组相似度97%)而宿主范围不同的虫种,即微小隐孢子虫(感染人、反刍动... 详细信息

隐孢子虫(Cryptosporidium)是感染人、反刍动物和其它哺乳动物的重要病原,可引起人兽共患的隐孢子虫病。课题组前期利用比较基因组学分析方法,通过对两个遗传相近(基因组相似度97%)而宿主范围不同的虫种,即微小隐孢子虫(感染人、反刍动物和啮齿类)和人隐孢子虫(只感染人)的基因组进行了比较,发现分泌型胰岛素水解酶和MEDLE蛋白家族的基因是微小隐孢子虫特异性基因,推测它们可能更多的与微小隐孢子虫感染宿主相关。然而目前这些蛋白家族在隐孢子虫入侵中的功能未知,尤其是MEDLE家族,在隐孢子虫以外的生物中没有发现。为了解MEDLE家族在隐孢子虫入侵过程中的作用,我们选取了微小隐孢子虫MEDLE特异性家族成员之一的cgd5590,对其基因进行表达。基于微小隐孢子虫基因数据库中cgd5590基因序列设计引物,进行PCR扩增得到567 bp的无信号肽的目的基因片段。回收纯化目的基因并将其连接至克隆载体pET-28a,转化至*** DH5α中进行克隆,然后挑取单克隆菌落进行菌液PCR鉴定和测序。将测序验证无误的重组质粒转化至*** BL21中进行原核诱导表达。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白免疫印迹(Western Blot)手段检测到21 kDa大小的蛋白,与预估分子量大小(21.0 kDa)相近,且经飞行时间质谱鉴定到MEDLE-2蛋白的肽段序列,从而确定表达产物为目的蛋白(MEDLE-2)。扩大诱导量并借助镍柱对表达产物进行亲和层析纯化获得浓度为500 μg/ml的纯化蛋白。将纯化得到的重组蛋白免疫家兔制备抗血清并纯化出多克隆抗体,利用间接免疫荧光的方法对目的蛋白进行定位,观察其在微小隐孢子虫虫体上的表达位置;同时应用定量PCR(qPCR)技术对目的基因的表达时期进行了分析。进一步进行免疫中和实验,将抗MEDLE-2蛋白的多克隆抗体对微小隐孢子虫孵育后侵染宿主细胞,查看其侵染率是否发生变化。结果显示目的蛋白分布在微小隐孢子虫子孢子体表面,其表达伴随着隐孢子虫入侵宿主的整个过程并且在入侵宿主后的48 h高表达;采用多克隆抗体对MEDLE家族表面蛋白进行中和发现微小隐孢子虫对宿主细胞的侵染率下降了 46%。综合上述结果,我们推测cgd5590基因编码的MEDLE-2蛋白参与了微小隐孢子虫宿主入侵过程,并且可能在其中发挥了重要的作用。

关键词：微小隐孢子虫 MEDLE家族蛋白荧光共定位实时荧光定量PCR 入侵

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

不同原因胸腔积液外泌体表征分析前瞻性研究

不同原因胸腔积液外泌体表征分析前瞻性研究

作者：彭怡昆明医科大学

学位级别：硕士

【目的】研究三种不同原因的胸腔积液中外泌体的数量、形态学和分子差异,即分析不同原因的胸腔积液中外泌体表征分析的异同。寻找能快速、准确鉴别胸腔积液病因的潜在工具。【方法】收集三种不同原因的胸腔积液:恶性(肺腺癌性)、结核性... 详细信息

【目的】研究三种不同原因的胸腔积液中外泌体的数量、形态学和分子差异,即分析不同原因的胸腔积液中外泌体表征分析的异同。寻找能快速、准确鉴别胸腔积液病因的潜在工具。【方法】收集三种不同原因的胸腔积液:恶性(肺腺癌性)、结核性、漏出性胸腔积液,采用Exo View外泌体检测试剂盒,利用单粒子干涉反射成像传感器技术(Single Particle Interferometric Reflcetance Imaging Sensor,SP-IRIS)及免疫捕获抗体捕获含特定蛋白标记物的外泌体,直接检测不同原因胸腔积液中外泌体数量、粒径大小。并通过荧光抗体标记外泌体表面蛋白来检测单个外泌体的表型。检测不同原因胸腔积液中的每个外泌体的荧光信号并进行统计,获得荧光共定位信息,进而比较三种不同原因的胸腔积液表征分析的异同点。【结果】1.不同原因胸腔积液中外泌体亚群计数及分布分析:三种不同原因的胸腔积液均为含CD63+或CD81+跨膜蛋白的外泌体数量最多,CD9+跨膜蛋白的外泌体数量最少,但均显著高于MIg G阴性对照。在三组不同原因的胸腔积液中含CD63+、CD81+和CD9+跨膜蛋白的外泌体数量均无显著统计学差异(P>0.05)。结核性胸腔积液中含CD9+跨膜蛋白的外泌体所占比例(B1:12.45%;B2:18.77%;B3:19.96%)低于肺腺癌性胸腔积液(A3:28.58%;A5:20.15%)及漏出液(C1:22.19%)。在肺腺癌性胸腔积液中外泌体的数量A5样本明显多于A3,A5样本中CD63+、CD9+外泌体亚群所占比例(37.07%、20.15%)低于A3样本(40.49%、28.58%)。而CD81+外泌体亚群所占比例A5高于A3(42.78%VS 31.03%)。在结核性胸腔积液中B1样本的外泌体数量明显多于B2和B3患者,CD63+外泌体亚群所占比例B1(49.35%)高于B2和B3(40.17%和34.29%);CD9+、CD81+外泌体亚群所占比例B1(12.45%、38.20%)低于B2(18.77%、41.06%)和B3(19.96%、46.38%)。2.不同原因胸腔积液中含不同跨膜蛋白的外泌体粒径大小:在肺腺癌性和结核性胸腔积液中,含CD81+跨膜蛋白的外泌体平均粒径最大,含CD9+跨膜蛋白的次之,含CD63+跨膜蛋白的最小。而在漏出性胸腔积液中,含CD63+、CD81+、CD9+的外泌体亚群平均粒径相同,均为57nm。但三组不同原因的胸腔积液中含CD63+、CD81+和CD9+跨膜蛋白的外泌体粒径大小均无统计差异(P>0.05)。3.不同原因胸腔积液在不同捕获抗体通道中荧光抗体数量对比:在CD63+捕获抗体通道中肺腺癌性胸腔积液和结核性胸腔积液中均为CD63荧光抗体数量最多,漏出液中CD81荧光抗体数量最多;在CD81+捕获抗体通道中肺腺癌性胸腔积液和漏出液均为CD9荧光抗体数量最多;在CD9+捕获抗体通道中结核性胸腔积液和漏出液均为CD81荧光抗体数量最多。肺腺癌性胸腔积液中,在CD63+捕获抗体通道二者均为被CD63荧光抗体标记的外泌体数量最多,在CD81+捕获抗体通道中均以CD9荧光抗体数最多,其余的外泌体荧光抗体数量分布均不相同。结核性胸腔积液中,在CD63+捕获抗体通道中,B1、B2、B3有相似的荧光抗体分布,均为CD63荧光抗体数量最多、CD81次之、CD9最少。B2和B3在CD81+和CD9+捕获抗体通道中有相似的荧光抗体数量分布趋势,在CD81+通道中均为被CD81荧光抗体标记的外泌体数量最多,CD63次之,CD9最少,在CD9+通道中为CD81荧光抗体标记的外泌体数量最多,被CD63和CD9荧光抗体标记的外泌体数差异不大,但均以被CD9荧光抗体标记的外泌体数稍多于CD63荧光抗体标记的外泌体。B1患者的分布明显不同于B2和B3,在CD81+捕获抗体通道中,被CD63荧光抗体标记的外泌体数量最多,CD81荧光次之,CD9最少;在CD9+捕获抗体通道中,被CD81荧光抗体标记的外泌体数量最多,CD63次之,CD9最少。4.不同原因胸腔积液外泌体共定位分析:在单阳的外泌体中,三种不同原因的胸腔积液均以CD63所占比例最高(A3:43.2%、A5:41.4%、B1:68.7%、B2:52%、B3:37.6%、C1:20%),在结核性胸腔积液中又以CD81次之(B1:17.4%、B2:28.7%、B3:25.3%),CD9最少(B1:10.5%、B2:14.9%、B3:12.8%)。在漏出性胸腔积液中无论是CD63+亚群、CD81+亚群还是CD9+亚群,均以CD63/81/9三阳的外泌体所占比例最高(分别为38.7%、35.6%、49.4%)。在3例结核性胸腔积液中,CD63+亚群中,双阳的外泌体CD6

关键词：跨膜蛋白漏出液肺腺癌结核性胸膜炎荧光共定位

AGO2相互作用蛋白PSMC3、DFFA对RNAi功能的影响

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

AGO2相互作用蛋白PSMC3、DFFA对RNAi功能的影响

作者：孔鹏洲天津医科大学

学位级别：硕士

目的： RNAi是生物体内基因转录后水平调节的重要方式。外源性的***和内源性的miRNA均可以做作为RNAi的触发器,可以对同源靶RNA诱导产生强大且特异性的剪切或抑制表达作用。RISC作为RNAi的效应器,发挥静默mRNA的作用。人类Argonaute2蛋... 详细信息

目的： RNAi是生物体内基因转录后水平调节的重要方式。外源性的***和内源性的miRNA均可以做作为RNAi的触发器,可以对同源靶RNA诱导产生强大且特异性的剪切或抑制表达作用。RISC作为RNAi的效应器,发挥静默mRNA的作用。人类Argonaute2蛋白是人类Argonaute蛋白家族中已知的唯一在RNAi起作用的成员,是RISC的核心成分之一,与siRNA即可构成最简单的效应器发挥剪切靶mRNA的作用。本实验室在前期工作中利用酵母双杂交系统从人类肺cDNA文库中筛选得到了一系列可能与人类Argonaute2蛋白PIWI(?)吉构域相互作用的蛋白,本文在前期工作的基础上选择了其中两个蛋白DFFA、 PSMC3进行深入研究,对其与Argonaute2蛋白的相互作用进行进一步验证,并研究了这两个蛋白对RNAi的影响,以期进一步深入了解RNAi的机制、探索RNAi可能的调控机制,为RNAi在临床上的应用提供理论依据。方法：选择本实验室在前期工作中利用酵母双杂交系统从人类肺cDNA文库中筛选得到的可能与人类Argonaute2蛋白PIWI结构域相互作用的两个蛋白DFFA、 PSMC3,利用免疫荧光技术,观察DFFA、PSMC3与AGO2蛋白在A549细胞内的共定位。通过分别转染***3表达质粒和特异性siRNA干扰DFFA、 PSMC3的表达来研究在活细胞内这两个蛋白对RNAi的影响。通过体外转录生成靶mRNA,利用细胞提取物来实现对靶nRNA的体外剪切,研究在细胞外这两个蛋白对RNAi的影响。结果： 1.免疫荧光证明DFFA、PSMC3与内源性、外源性转染的AGO2蛋白共定位于细胞浆中。 2. ***3的过表达在siRNA量为100nM时对RNAi的影响不明显,DFFA、PSMC3的过表达在siRNA量为50nM时对RNAi有促进作用,用特异性siRNA干扰DFFA、PSMC3的表达可以抑制RNAi的效果。 3.通过体外剪切靶mRNA,证实了DFFA、PSMC3的过表达对RNAi的影响不明显,特异性siRNA干扰DFFA、PSMC3的表达可以抑制RNAi的效果。结论：免疫荧光技术证实了细胞内DFFA、PSMC3与AG02蛋白存在共同定位,DFFA、PSMC3可以通过与AG02的相互作用影响RNAi、DFFA、PSMC3的过表达在siRNA饱和时对RNAi的影响不明显,DFFA、PSMC3的过表达在siRNA不饱和时可以促进RNAi的效果,DFFA、PSMC3的低表达可以抑制RNAi的效果。DFFA可能作为AG02蛋白的伴侣分子存在,参与AG02蛋白功能的正确发挥。PSMC3作为一种ATPase,兼有解旋酶的活性,则可能在RNAi过程中为siRNA的解旋提供能量,同时作为26S蛋白酶体的一部分,也有可能参与基因翻译起始后抑制。这两个与AG02蛋白相互作用蛋白的发现为RNAi调控机制提出了一种新的可能机制。

关键词： RNAi Argonaute2 DFFA PSMC3 荧光共定位体外剪切

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

鸡基质蛋白3在新城疫病毒复制中的作用研究

鸡基质蛋白3在新城疫病毒复制中的作用研究

作者：邓珊珊贵州大学

学位级别：硕士

新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)是一种有囊膜,含有单股负链、不分节段基因组的RNA病毒,其基因组结构为3’-NP-P-M-F-HN-L-5’,至少编码六种结构蛋白。基质蛋白(matrix protein,M)是NDV M基因编码的一种分子量为40 kD,位于病... 详细信息

新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)是一种有囊膜,含有单股负链、不分节段基因组的RNA病毒,其基因组结构为3’-NP-P-M-F-HN-L-5’,至少编码六种结构蛋白。基质蛋白(matrix protein,M)是NDV M基因编码的一种分子量为40 kD,位于病毒囊膜内侧且高度碱性的疏水性蛋白。与大多数副黏病毒M蛋白一样,NDV M蛋白也是一种细胞核-细胞质穿梭蛋白,即在病毒感染早期M蛋白通过自身携带的核定位信号(nuclear localization signal,NLS)与importinβ1相互作用并且以RanGTP依赖的方式进入细胞核,而在感染后期M蛋白则通过三个核输出信号以CRM1非依赖的方式进入细胞质。细胞基质蛋白3(matrin 3,MATR3)是最早报道的12种主要核基质蛋白之一,主要定位在细胞核,在不同的细胞类型中广泛表达且高度保守。MATR3蛋白与转录调节、mRNA前体剪接和稳定性、DNA损伤修复和细胞增殖等功能密切相关,并且还参与调控病毒RNA的核输出、病毒基因组的稳定性和表达。本课题组前期利用酵母双杂交系统从鸡胚成纤维细胞cDNA文库中筛选到NDV M蛋白和鸡MATR3蛋白存在相互作用,但是这种互作在NDV复制中的作用尚不清楚。本研究首先对鸡MATR3基因进行克隆和生物信息学分析,鉴定介导MATR3蛋白细胞核定位的核定位信号,然后构建M基因和MATR3基因真核表达载体,通过荧光共定位和免疫共沉淀技术验证M蛋白和MATR3蛋白之间的相互作用,最后利用RNA干扰技术干扰BSR-T7/5细胞中MATR3蛋白的表达,研究其对NDV复制的影响。1.鸡MATR3基因的克隆和生物信息学分析参照GenBank中登录的鸡MATR3基因序列(序列号:NM04147),设计合成特异性引物,通过RT-PCR从DF-1细胞中扩增出鸡MATR3基因,并进行克隆和测序。利用生物信息学软件对其编码的蛋白质进行理化性质、二级结构和三级结构分析,预测其功能结构域,并绘制遗传进化树。结果表明,鸡MATR3基因ORF序列全长为2 709 bp,共编码902个氨基酸,理论pI为5.79,分子质量约为100.71 kDa,分子式可表示为CHNOS;二级结构预测可知鸡MATR3蛋白含有丰富的二级结构,以无规则卷曲(47.67%)和α-螺旋(33.81%)为主;功能结构域预测显示该蛋白有2个锌指结构域和2个RNA识别基序。核苷酸同源性及遗传进化分析表明鸡与火鸡亲缘关系最近。2.鸡MATR3蛋白核定位信号的预测与鉴定运用在线软件对鸡MATR3蛋白NLS进行预测;参照GenBank中登录的鸡MATR3基因序列,设计合成Overlap PCR引物,构建表达不同鸡MATR3蛋白缺失体的重组真核表达载体,转染细胞后通过观察亚细胞定位来确定鸡MATR3蛋白NLS结构域;进一步根据NLS邻近碱性氨基酸序列特征,构建NLS邻近氨基酸缺失的重组真核表达载体,观察NLS邻近碱性氨基酸是否也参与鸡MATR3蛋白的细胞核定位。结果表明,鸡MATR3蛋白存在4个假定NLS(putative NLS,pNLS),只有pNLS2(PSDKKSK)缺失时才导致鸡MATR3蛋白丧失核定位特征。并且,鸡MATR3蛋白NLS邻近碱性氨基酸不参与NLS介导的MATR3蛋白细胞核定位。此外,我们还发现该NLS基序在不同物种的MATR3蛋白中均保守,并且与SV40大T抗原NLS具有相同的核输入能力。3.鸡MATR3蛋白与NDV M蛋白相互作用的验证参照GenBank中登录的鸡MATR3基因序列和NDV SS1株M基因序列,分别设计合成特异性引物构建重组真核表达载体pDsRed-MATR3、pCMV-Myc-MATR3和pEGFP-M,将pDsRed-MATR3和pEGFP-M共转染细胞,观察鸡MATR3蛋白和M蛋白共定位情况;将pCMV-Myc-MATR3和pEGFP-M共转染细胞,利用免疫共沉淀方法鉴定鸡MATR3蛋白与M蛋白的相互作用。结果表明,EGFP-M和DsRed-MATR3融合蛋白均分布在细胞核,在细胞核中有明显的共定位;免疫共沉淀结果显示EGFP-M可与Myc-MATR3发生共沉淀,反之Myc-MATR3也可与EGFP-M发生共沉淀。以上结果表明,鸡MATR3蛋白和NDV M蛋白在细胞核中发生相互作用。4.干扰细胞中MATR3蛋白的表达对NDV复制的影响将MATR3 siRNA转染BSR-T7/5细胞,验证siRNA对细胞中MATR3蛋白表达的影响,然后在siRNA转染细胞后36 h感染1 MOI的NDV,观察不同时间点的细胞病变情况并测定细胞上清的病毒滴度,同时用荧光定量PCR方法检测病毒感染细胞24 h后细胞沉淀和细胞上清中NDV M基因m

关键词：新城疫病毒 M蛋白 MATR3蛋白荧光共定位免疫共沉淀 RNA干扰

模型生物膜体系的构建及其基于磷脂酶A2的水解研究

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

模型生物膜体系的构建及其基于磷脂酶A2的水解研究

作者：开思琪东南大学

学位级别：硕士

本实验通过构建模型生物膜体系,并利用和频振动光谱(SFG)、共聚焦荧光显微镜(LSCM)衰减全反射红外光谱(ATR-FTIR)等多种表征手段,在形态学、反应动力学和分子结构等方面全面探究磷脂酶A2与生物膜的作用,从现象到分子层面对磷脂酶A2的水... 详细信息

本实验通过构建模型生物膜体系,并利用和频振动光谱(SFG)、共聚焦荧光显微镜(LSCM)衰减全反射红外光谱(ATR-FTIR)等多种表征手段,在形态学、反应动力学和分子结构等方面全面探究磷脂酶A2与生物膜的作用,从现象到分子层面对磷脂酶A2的水解作用提供一个深入、一致的系统性解释,为磷脂酶的生物学研究提供一个较为完整的模型。本文通过三种光学技术——和频振动光谱(SFG)、共聚焦荧光显微镜(LSCM)和衰减全反射红外光谱(ATR-FTIR),研究了平面磷脂双分子层在钙离子依赖性蜂毒磷脂酶A(bvPLA)作用下的水解过程。研究采用荧光共定位的方法,通过LSCM观测,追踪水解的动态过程和形态学变化,半定量以及定性地阐释了水解产物的空间分布情况。结果表明,水解产物之一的脂肪酸大部分从界面上脱离并游离到溶液介质当中,而另一个水解产物溶血磷脂则在界面上形成了稳定的自组装微管结构。ATR-FTIR实验的观测结果同样佐证了这一动态过程。SFG实验明确地揭示了钙离子在水解过程中发挥的作用,即通过连接磷脂膜和吸附在其表面的磷脂酶,诱导磷脂酶分子取向发生变化,从而有效激发界面上磷脂的水解反应。本研究以界面磷脂水解反应为例,建立了一个基于现代光学技术、能够在分子和微观层面上表征界面信息的实验体系,对于探究和理解磷脂水解的这一重要的生物物理化学过程有很大的帮助。此外,为了优化和扩展实验体系,本文在其他荧光标记手段上和多种模型双层膜制备上有所尝试,制备出可用于荧光标记且不易淬灭的新型硅量子点,并制备了软基底的磷脂分子双分子层和二氧化硅微球支撑双分子层,使本文研究方法在将来能够继续拓展,以在基础研究方面开发出更大的价值。

关键词：模型生物膜磷脂酶A2 和频振动光谱荧光共定位