微小隐孢子虫MEDLE家族成员蛋白的表达与功能验证

作     者：李宝玲 

作者单位：华东理工大学 

学位级别：硕士

导师姓名：冯耀宇

授予年度：2017年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：微小隐孢子虫 MEDLE家族蛋白 荧光共定位 实时荧光定量PCR 入侵 

摘      要：隐孢子虫(Cryptosporidium)是感染人、反刍动物和其它哺乳动物的重要病原,可引起人兽共患的隐孢子虫病。课题组前期利用比较基因组学分析方法,通过对两个遗传相近(基因组相似度97%)而宿主范围不同的虫种,即微小隐孢子虫(感染人、反刍动物和啮齿类)和人隐孢子虫(只感染人)的基因组进行了比较,发现分泌型胰岛素水解酶和MEDLE蛋白家族的基因是微小隐孢子虫特异性基因,推测它们可能更多的与微小隐孢子虫感染宿主相关。然而目前这些蛋白家族在隐孢子虫入侵中的功能未知,尤其是MEDLE家族,在隐孢子虫以外的生物中没有发现。为了解MEDLE家族在隐孢子虫入侵过程中的作用,我们选取了微小隐孢子虫MEDLE特异性家族成员之一的cgd5590,对其基因进行表达。基于微小隐孢子虫基因数据库中cgd5590基因序列设计引物,进行PCR扩增得到567 bp的无信号肽的目的基因片段。回收纯化目的基因并将其连接至克隆载体pET-28a,转化至*** DH5α中进行克隆,然后挑取单克隆菌落进行菌液PCR鉴定和测序。将测序验证无误的重组质粒转化至*** BL21中进行原核诱导表达。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白免疫印迹(Western Blot)手段检测到21 kDa大小的蛋白,与预估分子量大小(21.0 kDa)相近,且经飞行时间质谱鉴定到MEDLE-2蛋白的肽段序列,从而确定表达产物为目的蛋白(MEDLE-2)。扩大诱导量并借助镍柱对表达产物进行亲和层析纯化获得浓度为500 μg/ml的纯化蛋白。将纯化得到的重组蛋白免疫家兔制备抗血清并纯化出多克隆抗体,利用间接免疫荧光的方法对目的蛋白进行定位,观察其在微小隐孢子虫虫体上的表达位置;同时应用定量PCR(qPCR)技术对目的基因的表达时期进行了分析。进一步进行免疫中和实验,将抗MEDLE-2蛋白的多克隆抗体对微小隐孢子虫孵育后侵染宿主细胞,查看其侵染率是否发生变化。结果显示目的蛋白分布在微小隐孢子虫子孢子体表面,其表达伴随着隐孢子虫入侵宿主的整个过程并且在入侵宿主后的48 h高表达;采用多克隆抗体对MEDLE家族表面蛋白进行中和发现微小隐孢子虫对宿主细胞的侵染率下降了 46%。综合上述结果,我们推测cgd5590基因编码的MEDLE-2蛋白参与了微小隐孢子虫宿主入侵过程,并且可能在其中发挥了重要的作用。