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苹果炭疽叶枯病菌单羧酸转运蛋白CgMCT1的功能分析

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苹果炭疽叶枯病菌单羧酸转运蛋白CgMCT1的功能分析

作者：赵璇竹中国农业科学院

学位级别：硕士

苹果炭疽叶枯病主要由胶胞炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioide）引起的一种真菌病害。该病原菌既侵染苹果叶片,又侵害果实,常造成树体早期大量落叶,严重削弱树势。被侵染的果实,在接近成熟时开始发病,造成采收前大量落果。苹果炭疽... 详细信息

苹果炭疽叶枯病主要由胶胞炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioide）引起的一种真菌病害。该病原菌既侵染苹果叶片,又侵害果实,常造成树体早期大量落叶,严重削弱树势。被侵染的果实,在接近成熟时开始发病,造成采收前大量落果。苹果炭疽叶枯病菌致病分子机理的深入研究不仅有助于了解其致害本质,也为植物病害的防治策略提供重要的参考信息。目前,苹果和胶胞炭疽菌全基因组测序的完成为苹果炭疽叶枯病菌致病机制研究提供了契机。本文通过筛选T-DNA插入突变体库,鉴定了1个苹果炭疽叶枯病菌致病相关基因CgMCT1。通过基因敲除、荧光示踪、亚细胞共定位等分子生物学技术和手段,结合表型分析、病理组织结构观察系统分析了CgMCT1在苹果炭疽叶枯病菌生长发育和致病过程中的功能,获得了主要研究结果如下:本研究从苹果炭疽叶枯病菌T-DNA插入突变体库中,筛选出一株致病力缺失的突变菌株（N7）。通过hiTail-PCR方法对T-DNA插入位点右翼序列进行了克隆和序列比对分析,发现T-DNA插入突变体标记的基因编码一个假定的单羧酸转运蛋白（Monocarboxylate transporter,MCT）,本研究将该基因命名为CgMCT1。CgMCT1的转录产物有两种可变剪切,分别命名为MctS1和MctS2,两种剪切产物功能一致。基因敲除、互补、表型分析结果表明,Δcgmct1突变体影响苹果炭疽叶枯病菌营养生长、色素沉积以及分生孢子形成。定量检测（q RT-PCR）和荧光示踪试验结果表明CgMCT1在菌丝、分生孢子、芽管和附着胞中均有表达。其中,分生孢子中的表达量最高。CgMCT1含有典型的跨膜结构域。CgMCT1-Tag RFP与MTS-e GFP共定位结果表明,CgMCT1定位于线粒体。CgMCT1不介导5种单羧酸化合物（乳酸、丙酮酸、醋酸、草酸和柠檬酸）的吸收。然而,在添加外源乳酸的MM培养基培养下,CgMCT1被诱导上调表达。这些结果推测CgMCT1位于线粒体上,参与乳酸的跨膜转运。Δcgmct1突变体对苹果叶片致病性完全丧失。Δcgmct1突变体侵染的寄主细胞内活性氧（ROS）异常积累,说明CgMCT1基因缺失导致的致病性缺陷可能与寄主抗病基因介导的防卫反应有关。由此,表明CgMCT1在苹果炭疽叶枯病与寄主植物互作中影响了病原菌的生长,导致了病原菌调控寄主ROS的能力下降。综上所述,本文阐明了单羧酸转运蛋白CgMCT1在苹果炭疽叶枯病菌的生长、发育、产孢以及致病性过程中生物学功能。研究结果有助于推进人们对单羧酸转运蛋白功能的认识,研究成果为炭疽菌新型防治药剂的开发提供了靶位点。

关键词：苹果炭疽叶枯病菌 CgMCT1基因单羧酸转运蛋白致病机制分生孢子

苹果炭疽叶枯病菌致病相关基因GcVIR1的克隆及功能分析

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苹果炭疽叶枯病菌致病相关基因GcVIR1的克隆及功能分析

作者：吴建圆中国农业科学院

学位级别：硕士

近几年,苹果一种重要的新病害——苹果炭疽叶枯病(Glomerella leaf spot of apple),在我国苹果主产区连年大发生,给苹果产业带来巨额损失。目前,关于该病害的研究主要集中在病原学、病害发生规律和防治方法,而关于病原菌致病的分子基础... 详细信息

近几年,苹果一种重要的新病害——苹果炭疽叶枯病(Glomerella leaf spot of apple),在我国苹果主产区连年大发生,给苹果产业带来巨额损失。目前,关于该病害的研究主要集中在病原学、病害发生规律和防治方法,而关于病原菌致病的分子基础研究较少。本研究开展了苹果炭疽叶枯病菌致病机理研究,旨为该病害防治的新途径、新方法提供线索。本研究首先对T-DNA插入突变体库中的部分转化子进行培养性状观测,获得与野生型菌株培养性状差异较大的菌株7株。其中突变体M22和M178的产孢量为野生型的10倍,突变体M17和M44失去了产孢能力,其他3株突变体的产孢量约为野生型的1%。致病力测定结果表明,7株突变体的致病能力均有下降,其中M44和M285完全失去了致病能力。Southern blot分析结果显示,7株突变体基因组中的T-DNA均是单拷贝插入。为分离因T-DNA插入受到影响的基因,本研究运用hiTail-PCR技术,并对PCR产物进行克隆测序,获得了T-DNA插入点的右翼序列,经与围小从壳菌菌株23基因组比对分析,获知突变体可能受到影响的基因分别为GcRRN3,GcRXT2,GcGD1,GcCON3,GcOPT2,GcMRP1和GcVIR1。为进一步鉴定候选基因,本研究采用RT-PCR技术对7个候选基因的转录情况进行了检测,7个基因在野生型菌株W16中均能扩增出单一条带,然而在各自突变体中无条带出现,表明7个候选基因在各自突变体中转录受到抑制。本研究其次对GcVIR1基因进行了深入分析。该基因全长1686 bp,不含有内含子,编码562个氨基酸。为进一步明确GcVIR1基因的功能,本研究构建了GcVIR1基因恢复载体,并借助农杆菌介导的遗传转化技术(ATMT)成功将GcVIR1基因转入GcVIR1突变体M285基因组中,获得了GcVIR1基因恢复菌株R-GcVIR1。表型测定结果显示,恢复菌株R-GcVIR1完全恢复了GcVIR1突变体M285的表型缺陷。为了确定GcVIR1蛋白的亚细胞定位,我们构建了GcVIR1-RFP融合表达的GcVIR1恢复菌株R-VIR1RFP。荧光显微镜下检测结果表明,GcVIR1分布于细胞质中。为明确GcVIR1在该菌中的时空表达模式,本研究利用q RT-PCR技术检测了GcVIR1在菌丝、分生孢子、芽管和附着胞的表达量,结果显示,GcVIR1在苹果炭疽叶枯病菌各个发育阶段都有表达,在分生孢子中相对表达量最高。胶胞炭疽菌通过分泌果胶酶(聚半乳糖醛酸酶、果胶裂解酶和果胶酸酯裂解酶),克服寄主细胞壁中的果胶,使其成功在寄主体内定殖。在本研究中,GcVIR1突变体失去了致病能力,因此我们利用qRT-PCR技术检测了果胶酶合成相关基因PG1、PG2、pnl-1、pnl-2和pelB在突变体M285中的表达情况。结果显示,PG1基因表达量升高至5.89倍,PG2基因表达量升高至4.58倍,其他3个基因与野生型菌株无差异。表明GcVIR1负调控PG1和PG2基因的表达。在胶孢炭疽菌中,由附着胞调节的侵入方式在其致病过程中起到重要作用,而丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)级联信号途径中相关基因CMK1、CPK1、MEK1和MAF1被证实在这一过程中起到重要的调控作用。考虑到GcVIR1突变体失去了产生附着胞的能力,本研究利用qRT-PCR技术检测了这些基因在突变体M285中的表达情况。结果显示,CMK1、CPK1、MEK1和MAF1在突变体M285中表达量(与野生型相比)无明显变化,因此,推测GcVIR1基因在功能上可能位于CMK1、CPK1、MEK1和MAF1基因的下游。

关键词：苹果炭疽叶枯病菌突变体致病相关基因致病机制

苹果炭疽叶枯病菌GTP结合蛋白GTPBP1的功能分析

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苹果炭疽叶枯病菌GTP结合蛋白GTPBP1的功能分析

作者：徐杰中国农业科学院

学位级别：硕士

苹果炭疽叶枯病(Glomerella leaf spot of apple)由胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)引起。病害连年的发生,对各地苹果产业和农业经济造成严重的损失。夏季雨热同期条件有利于该病害爆发,该病原菌扩散速度极强,从侵染叶片到... 详细信息

苹果炭疽叶枯病(Glomerella leaf spot of apple)由胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)引起。病害连年的发生,对各地苹果产业和农业经济造成严重的损失。夏季雨热同期条件有利于该病害爆发,该病原菌扩散速度极强,从侵染叶片到始见病斑仅需2-3天,在5天左右会造成树体大量落叶,发病最严重的果园,叶片、果实发病率均达100%。通过对炭疽叶枯病菌致病分子机理的了解,可以为找到苹果炭疽叶枯病的防治方法提供理论指导。本论文对T-DNA插入突变体库中的A1860菌株进行培养和致病性鉴定,发现该突变体丧失了致病性,Southern blot分析,发现该突变体是单拷贝插入。采用hi Tail-PCR技术,扩增到T-DNA插入位点的右翼序列,对扩增后的序列进行测序并与已发表的其他围小从壳菌菌株基因组进行比对分析,发现该突变体插入的位置影响了GTPBP1基因的表达。对该序列做进一步分析,发现苹果炭疽GTPBP1基因核苷酸序列包含1950bp,能够编码649个氨基酸。为确证GTPBP1基因的致病功能,利用同源重组技术构建该基因的敲除载体和回补载体,通过农杆菌介导的遗传转化方法构建了该基因的敲除突变体和回补菌株,敲除突变体菌株与插入突变体菌株一样丧失了致病性,但回补菌株完全恢复了敲除突变体菌株的致病性缺陷,证明了GTPBP1基因切实为致病相关基因。为解析GTPBP1基因的致病机制及其生理机制,开展了其编码蛋白的亚细胞定位、关联基因和对孢子形态维持等研究:(1)GTPBP1蛋白的亚细胞定位情况:将该基因与mCheery荧光标记基因进行蛋白融合,构成含有荧光标记菌株GTPBP1-R,结果表明,GTPBP1蛋白定位在细胞质中且成点状分布,利用实时荧光定量法检测GTPBP1基因在菌株生长发育各阶段的表达量,结果发现,在该病菌各个发育阶段的过程中都有GTPBP1基因的表达,但GTPBP1在分生孢子阶段中的表达量达到最高。(2)孢子形态维持和生理功能研究:孢子形态观测,发现敲除突变体分生孢子形态明显与野生型不同,猜测可能是分生孢子中微管蛋白结构形态发生了变化,将微管蛋白标记基因与GFP荧光蛋白进行融合,分别转化到野生型和敲除菌株中,发现野生型菌株的微管蛋白呈网状,而敲除突变体中的蛋白是点状分布,说明GTPBP1基因可能参与了分生孢子中微管蛋白结构的形成;我们接着对ΔGTPBP1突变体进行了胁迫反应,发现该基因参与氧化胁迫和离子胁迫的应答反应。(3)生物学和致病关联基因研究:有研究发现炭疽菌通过逃避寄主组织细胞中果胶的识别,从而达到侵染寄主的目的。采用qRT-PCR方法检测果胶酶合成相关基因CgPG1、CgPG2、pnl-1、pnl-2、pelA和pelB在野生型和敲除突变体菌株中的表达情况。结果显示,野生型菌株中CgPG1、CgPG2、pn1-2和pelA的表达量要低于敲除突变体,说明GTPBP1负调控CgPG1、CgPG2、pn1-2和pelA基因的表达。因ΔGTPBP1突变体丧失了对寄主的致病能力,为探究该突变体是否受MAPK信号途径中的相关基因的影响,利用qRT-PCR技术检测相关基因在ΔGTPBP1和W16菌株的相对表达量,结果显示,ΔGTPBP1中CPK1基因表达上调,GTPBP1负调控CPK1基因的表达。从外源加入cAMP的实验中,推测GTPBP1基因不通过依赖cAMP信号传导途径调控附着胞的形成。

关键词：苹果炭疽叶枯病菌 GTPBP1基因致病机制表型分析

高效液相色谱法测定苹果炭疽叶枯病菌培养液及染病寄主中的尿嘧啶

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分析试验室 2023年第8期42卷 1013-1019页

作者：于鑫邢小霞董向丽李平亮青岛农业大学植物医学学院山东省植物病虫害绿色防控工程研究中心青岛266109

建立了病菌培养液及染病寄主苹果叶片中尿嘧啶的高效液相色谱分析方法。优化条件下,病菌培养液和叶片基质中方法的检出限(LODs)分别为0.10 mg/L和0.25 mg/kg,添加回收率范围为83.7%~94.7%。测定了Richard和PDB 2种病菌培养液以及接种病... 详细信息

建立了病菌培养液及染病寄主苹果叶片中尿嘧啶的高效液相色谱分析方法。优化条件下,病菌培养液和叶片基质中方法的检出限(LODs)分别为0.10 mg/L和0.25 mg/kg,添加回收率范围为83.7%~94.7%。测定了Richard和PDB 2种病菌培养液以及接种病菌染病后寄主叶片中尿嘧啶的含量变化。结果显示:接种病菌后1~7 d, Richard培养液和PDB培养液中尿嘧啶含量均随时间延长逐渐上升,含量范围分别为1.18~5.58 mg/L和3.13~8.26 mg/L;健康叶片、病症较轻和较重叶片中尿嘧啶含量分别为:低于LOD、 4.18 mg/kg和58.49 mg/kg。

关键词：苹果炭疽叶枯病菌高效液相色谱法尿嘧啶病菌培养液苹果叶片

解淀粉芽胞杆菌TS-1203对苹果炭疽叶枯病菌的抗生作用

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植物保护 2021年第4期47卷 46-51,58页

作者：朱娜张树武徐秉良刘佳甘肃农业大学植物保护学院甘肃省农作物病虫害生物防治工程实验室兰州730070

为明确解淀粉芽胞杆菌TS-1203对苹果炭疽叶枯病菌的抗生作用,采用平板对峙法和菌丝生长速率法以及孢子萌发法测定了解淀粉芽胞杆菌TS-1203对苹果炭疽叶枯病菌菌落生长和孢子萌发的抑制作用。结果表明:菌株TS-1203对苹果炭疽叶枯病菌具... 详细信息

为明确解淀粉芽胞杆菌TS-1203对苹果炭疽叶枯病菌的抗生作用,采用平板对峙法和菌丝生长速率法以及孢子萌发法测定了解淀粉芽胞杆菌TS-1203对苹果炭疽叶枯病菌菌落生长和孢子萌发的抑制作用。结果表明:菌株TS-1203对苹果炭疽叶枯病菌具有显著的抑制作用,其菌液对病菌的抑制率高达70.4%;其发酵液对苹果炭疽叶枯病菌的抑制率随着发酵液浓度的增加而升高,尤其当发酵液浓度为15%时,其抑菌率为59.0%;发酵液处理苹果炭疽叶枯病菌孢子24 h后,其萌发抑制率与芽管生长抑制率分别为78.2%与64.3%,且芽管出现畸形;利用TS-1203发酵液处理苹果离体叶片后接种炭疽叶枯病菌,其防效为70.1%。综合分析表明,解淀粉芽胞杆菌TS-1203对苹果炭疽叶枯病菌具有良好的抑制作用。

关键词：苹果炭疽叶枯病菌解淀粉芽胞杆菌菌落生长孢子萌发抑制作用

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苹果炭疽叶枯病菌致病因素及综合防治措施

果农之友 2023年第5期 74-76页

作者：隋颖光辽宁省阜新蒙古族自治县沙拉镇农业综合服务中心辽宁阜新123000

病虫害管理是果树种植过程中的重点工作,直接影响农户的经济收入和当地果业持续发展,因此不能忽视.近年来,在我国苹果主产区发现了一种新型病害——苹果炭疽叶枯病菌,此病害已在河南、陕西、山东、辽宁、山西等苹果主产省被发现,并有蔓... 详细信息

病虫害管理是果树种植过程中的重点工作,直接影响农户的经济收入和当地果业持续发展,因此不能忽视.近年来,在我国苹果主产区发现了一种新型病害——苹果炭疽叶枯病菌,此病害已在河南、陕西、山东、辽宁、山西等苹果主产省被发现,并有蔓延的趋势.该病害的特点是传播速度快、危害性强、快速导致落叶、严重影响产量.如果不高度重视,不及时采取有效的防治措施,将给果业生产造成较大的经济损失.

关键词：苹果炭疽叶枯病菌致病因素综合防治

9种生物源杀菌剂对苹果炭疽叶枯病菌的室内活性评价

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南方农业 2020年第15期14卷 133-134页

作者：常翠莲渠非冯浩黄丽丽西北农林科技大学植物保护学院陕西杨凌712100

为筛选出对苹果炭疽叶枯病菌具有较好抑菌效果的生物源杀菌剂,采用菌丝生长速率法,测定了9种生物源杀菌剂对苹果炭疽叶枯病菌的室内毒力.结果表明,除0.5%大黄素甲醚AS和青枯立克AS对苹果炭疽叶枯病菌没有抑菌效果外,其余7种供试药剂均... 详细信息

为筛选出对苹果炭疽叶枯病菌具有较好抑菌效果的生物源杀菌剂,采用菌丝生长速率法,测定了9种生物源杀菌剂对苹果炭疽叶枯病菌的室内毒力.结果表明,除0.5%大黄素甲醚AS和青枯立克AS对苹果炭疽叶枯病菌没有抑菌效果外,其余7种供试药剂均有一定的抑菌效果.其中,100万/g寡雄腐霉菌WP和1%维大利DP的室内毒力最强,其次为大蒜油EC和5%香芹酚AS,2亿/g木霉菌WP、1%蛇床子素EW、0.3%丁子香酚SL抑菌效果相对较弱.

关键词：苹果炭疽叶枯病菌生物源杀菌剂毒力测定

长枝木霉T6菌株可湿性粉剂研制及复配菌剂协同增效作用研究

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长枝木霉T6菌株可湿性粉剂研制及复配菌剂协同增效作用研究

作者：戴启星甘肃农业大学

学位级别：硕士

近年来,苹果斑点落叶病和苹果炭疽叶枯病严重影响我国苹果的生产。目前,国内外对于苹果斑点落叶病和苹果炭疽叶枯病的防治仍以化学杀菌剂作为主要的防治措施,但是化学杀菌剂的使用带来了果实质量下降和有害物质超标,以及生态破坏和环境... 详细信息

近年来,苹果斑点落叶病和苹果炭疽叶枯病严重影响我国苹果的生产。目前,国内外对于苹果斑点落叶病和苹果炭疽叶枯病的防治仍以化学杀菌剂作为主要的防治措施,但是化学杀菌剂的使用带来了果实质量下降和有害物质超标,以及生态破坏和环境污染等问题,严重影响了食物安全和人类健康。生物防治可作为一种环境友好型的病害防治技术,是目前替代化学农药的一种有效措施,已成为国内外研究的热点。因此,本研究通过长枝木霉T6菌株可湿性粉剂的制备工艺优化、研制和防效评价,以及长枝木霉T6与解淀粉芽孢杆菌TS-1203复配对苹果斑点落叶病和炭疽叶枯病协同防治作用研究,旨在为苹果主要病害的生物防治提供一定的理论依据。取得如下主要结果:1.采取菌丝生长速率法分别测定了不同载体和助剂对长枝木霉T6菌株菌丝生长量及其产孢量的影响,对其载体及助剂进行配方优化。结果表明最佳配方为:分生孢子量(10%),分散剂为木质素磺酸纳(5%),粘着剂为黄原胶(0.05%)润湿剂为十二烷基硫酸钠(0.6%),孢子萌发促进剂为硫酸锌(0.1%),紫外保护剂为炭黑(0.3%),载体为滑石粉(补足100%)。在此配方下长枝木霉T6可湿性粉剂对苹果斑点落叶病和苹果炭疽叶枯病的防治效果最佳,分别为80.63%和93.75%。2.研制获得的长枝木霉T6可湿性粉剂具有较好的流动性,98%通过200目筛,悬浮率82.66%,含水量≦2%,pH 8.5,起泡性18 mL,湿润时间41s,且在经过热贮藏后未出现结块和涨袋等现象,孢子萌发正常,活菌数11.66×10cfu/mL,各项指标均与国家质量标准基本一致。长枝木霉T6可湿性粉剂处理苹果斑点落叶病菌和炭疽叶枯病菌后期菌丝出现畸形、扭曲、膨大、断裂和原生质体凝集等现象。同时,长枝木霉T6可湿性粉剂1000倍液对两种病原菌的孢子萌发具有显著的抑制作用,其对苹果斑点落叶病孢子萌发抑制率为80.32%,苹果炭疽叶枯病孢子萌发抑制率为92.09%。3.采用菌丝生长速率法测定了长枝木霉T6与解淀粉芽孢杆菌TS-1203复配发酵液对苹果斑点落叶病协同防治作用。结果表明,与单一长枝木霉T6和解淀粉芽孢杆菌TS-1203发酵液相比,复配发酵液对苹果斑点落叶病的防治效果具有显著的协同增效作用。处理7 d后,长枝木霉T6与解淀粉芽孢杆菌TS-1203复配发酵液对苹果斑点落叶病菌的抑制率为93.88%,且其最佳抑菌浓度为0.04g/mL,混配发酵液最佳配比为3:1,而单一的长枝木霉T6菌株发酵液对其抑菌率为81.80%,解淀粉芽孢杆菌TS-1203发酵液对其抑菌率为75.82%。

关键词：苹果斑点落叶病菌苹果炭疽叶枯病菌长枝木霉T6菌株解淀粉芽孢杆菌TS-1203 可湿性粉剂协同防治作用生物防治

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苹果MdT5H1的克隆和功能分析

苹果MdT5H1的克隆和功能分析