苹果炭疽叶枯病菌GTP结合蛋白GTPBP1的功能分析

作     者：徐杰 

作者单位：中国农业科学院 

学位级别：硕士

导师姓名：周宗山

授予年度：2020年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学] 090402[农学-农业昆虫与害虫防治] 

主      题：苹果炭疽叶枯病菌 GTPBP1基因 致病机制 表型分析 

摘      要：苹果炭疽叶枯病(Glomerella leaf spot of apple)由胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)引起。病害连年的发生,对各地苹果产业和农业经济造成严重的损失。夏季雨热同期条件有利于该病害爆发,该病原菌扩散速度极强,从侵染叶片到始见病斑仅需2-3天,在5天左右会造成树体大量落叶,发病最严重的果园,叶片、果实发病率均达100%。通过对炭疽叶枯病菌致病分子机理的了解,可以为找到苹果炭疽叶枯病的防治方法提供理论指导。本论文对T-DNA插入突变体库中的A1860菌株进行培养和致病性鉴定,发现该突变体丧失了致病性,Southern blot分析,发现该突变体是单拷贝插入。采用hi Tail-PCR技术,扩增到T-DNA插入位点的右翼序列,对扩增后的序列进行测序并与已发表的其他围小从壳菌菌株基因组进行比对分析,发现该突变体插入的位置影响了GTPBP1基因的表达。对该序列做进一步分析,发现苹果炭疽GTPBP1基因核苷酸序列包含1950bp,能够编码649个氨基酸。为确证GTPBP1基因的致病功能,利用同源重组技术构建该基因的敲除载体和回补载体,通过农杆菌介导的遗传转化方法构建了该基因的敲除突变体和回补菌株,敲除突变体菌株与插入突变体菌株一样丧失了致病性,但回补菌株完全恢复了敲除突变体菌株的致病性缺陷,证明了GTPBP1基因切实为致病相关基因。为解析GTPBP1基因的致病机制及其生理机制,开展了其编码蛋白的亚细胞定位、关联基因和对孢子形态维持等研究:(1)GTPBP1蛋白的亚细胞定位情况:将该基因与mCheery荧光标记基因进行蛋白融合,构成含有荧光标记菌株GTPBP1-R,结果表明,GTPBP1蛋白定位在细胞质中且成点状分布,利用实时荧光定量法检测GTPBP1基因在菌株生长发育各阶段的表达量,结果发现,在该病菌各个发育阶段的过程中都有GTPBP1基因的表达,但GTPBP1在分生孢子阶段中的表达量达到最高。(2)孢子形态维持和生理功能研究:孢子形态观测,发现敲除突变体分生孢子形态明显与野生型不同,猜测可能是分生孢子中微管蛋白结构形态发生了变化,将微管蛋白标记基因与GFP荧光蛋白进行融合,分别转化到野生型和敲除菌株中,发现野生型菌株的微管蛋白呈网状,而敲除突变体中的蛋白是点状分布,说明GTPBP1基因可能参与了分生孢子中微管蛋白结构的形成;我们接着对ΔGTPBP1突变体进行了胁迫反应,发现该基因参与氧化胁迫和离子胁迫的应答反应。(3)生物学和致病关联基因研究:有研究发现炭疽菌通过逃避寄主组织细胞中果胶的识别,从而达到侵染寄主的目的。采用qRT-PCR方法检测果胶酶合成相关基因CgPG1、CgPG2、pnl-1、pnl-2、pelA和pelB在野生型和敲除突变体菌株中的表达情况。结果显示,野生型菌株中CgPG1、CgPG2、pn1-2和pelA的表达量要低于敲除突变体,说明GTPBP1负调控CgPG1、CgPG2、pn1-2和pelA基因的表达。因ΔGTPBP1突变体丧失了对寄主的致病能力,为探究该突变体是否受MAPK信号途径中的相关基因的影响,利用qRT-PCR技术检测相关基因在ΔGTPBP1和W16菌株的相对表达量,结果显示,ΔGTPBP1中CPK1基因表达上调,GTPBP1负调控CPK1基因的表达。从外源加入cAMP的实验中,推测GTPBP1基因不通过依赖cAMP信号传导途径调控附着胞的形成。