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中国生物化学与分子生物学报 2017年第1期33卷 73-80页

作者：郭培钰崔晓东贾乔瑾吕彦王转花化学生物学与分子工程教育部重点实验室山西大学生物技术研究所太原030006

苦荞凝集素(tartary buckwheat lectin,TBL)是一类兼具核糖体失活蛋白N-糖苷酶活性和芦丁水解酶活性的糖蛋白,具有显著的抑制结肠癌细胞增殖的功能。先前研究表明,TBL可以下调结肠癌细胞HCT116中包括miR-135a和miR-135b在内的一些oncom... 详细信息

苦荞凝集素(tartary buckwheat lectin,TBL)是一类兼具核糖体失活蛋白N-糖苷酶活性和芦丁水解酶活性的糖蛋白,具有显著的抑制结肠癌细胞增殖的功能。先前研究表明,TBL可以下调结肠癌细胞HCT116中包括miR-135a和miR-135b在内的一些oncomiRs的表达,并且可以抑制结肠癌细胞HCT116的增殖。因此,我们推测TBL可能通过调控oncomiRs从而抑制HCT116细胞的增殖。本研究中,我们构建了包含miR-135a和miR-135b结合位点的腺瘤性结肠息肉病基因(adenomatous polyposis coli,APC)的3'-UTR区。双荧光素酶报告系统表明,经过TBL处理后,实验组的荧光素酶活性较对照组高,而且用miR-135a&b的反义核酸anti-miR-135a&b处理后和实验组有相似的结果。Western印迹分析表明,TBL处理HCT116细胞24 h后,细胞中APC和p-β-catenin的表达上调,总β-catenin的表达下调,且存在剂量依赖效应,而对GSK-3β的表达无明显影响。进一步探究了TBL进入细胞的方式,我们发现,加入TBL作用2 h后,其主要存在于HCT116细胞的表面,部分进入细胞内部,在细胞表面可以同半乳糖凝集素galectin-3竞争结合细胞膜表面受体,并且存在剂量和时间依赖性。这些结果表明:TBL以HCT116细胞表面的galectin-3受体为靶点,通过内吞作用进入细胞,进而调控HCT116细胞中miR-135a&b的表达,影响Wnt信号通路而抑制结肠癌细胞的增殖。

关键词：苦荞凝集素 miR-135a&b 腺瘤性结肠息肉基因结肠癌细胞 Wnt信号通路

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苦荞凝集素对结肠癌细胞增殖的抑制作用

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中国生物化学与分子生物学报 2015年第4期31卷 383-390页

作者：贾乔瑾崔晓东王转花山西大学生物技术研究所、化学生物学与分子工程教育部重点实验室太原030006

采用醋酸铵缓冲液抽提、硫酸铵分级沉淀、阴离子交换和分子排阻层析等方法,首次从苦荞麦中提取出一种苦荞凝集素(tatary buckwheat lectin,TBL).MTT检测发现,TBL对3种结肠癌细胞DLD-1、HCT116及SW480的增殖有显著的抑制作用,且呈剂量依... 详细信息

采用醋酸铵缓冲液抽提、硫酸铵分级沉淀、阴离子交换和分子排阻层析等方法,首次从苦荞麦中提取出一种苦荞凝集素(tatary buckwheat lectin,TBL).MTT检测发现,TBL对3种结肠癌细胞DLD-1、HCT116及SW480的增殖有显著的抑制作用,且呈剂量依赖效应,而对正常细胞及其它类型癌细胞的增殖无明显影响.采用兔网织红细胞裂解系统和荧光素酶检测系统检测TBL对蛋白质合成的影响,结果表明,随着TBL浓度的增大,蛋白质翻译抑制作用逐渐增强,当TBL浓度为40μg/m L时荧光素酶活性下降至50%.另外,TBL与兔网织红细胞裂解系统作用后,核糖体RNA出现新的片段,表明TBL具有N-糖苷酶的活性.将HCT116细胞总RNA与TBL体外作用后,发现二者存在明显的相互作用,核糖体RNA被降解.qRT-PCR检测显示,TBL明显下调HCT116细胞中多种microRNAs(miRNAs)表达.综合以上实验得出,TBL是一种Ⅱ型核糖体失活蛋白(type-Ⅱribosome-inactivating protein,Ⅱ-RIP)类的植物凝集素,具有N-糖苷酶活性,可下调肠癌细胞中多种miRNAs的表达,抑制结肠癌细胞增殖.

关键词：苦荞凝集素 Ⅱ型核糖体失活蛋白(Ⅱ-RIP) 肠癌抗癌作用

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苦荞凝集素通过下调miR-21的表达抑制结肠癌细胞增殖的研究

苦荞凝集素通过下调miR-21的表达抑制结肠癌细胞增殖的研究

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作者：郭培钰山西大学

学位级别：硕士

miRNA是一类由18-25个核苷酸组成的、可以对相应靶基因进行负调控的单链RNA分子。作为基因调控的方式,miRNA是在基因转录后阶段进行调控,人体内大约有三分之一的基因都受到miRNA的调节,因此miRNA对生命的调节是一个广泛存在的过程。一... 详细信息

miRNA是一类由18-25个核苷酸组成的、可以对相应靶基因进行负调控的单链RNA分子。作为基因调控的方式,miRNA是在基因转录后阶段进行调控,人体内大约有三分之一的基因都受到miRNA的调节,因此miRNA对生命的调节是一个广泛存在的过程。一些可以起到抑制癌症的miRNA称之为抑癌miRNA,与癌症发生发展紧密相关的miRNA称之为癌miRNA。越来越多的分子学研究证据表明,在许多肿瘤细胞中,miRNA的表达是失调的,而癌miRNA一般都过量表达,因此癌miRNA可以作为癌症治疗的有效靶点。苦荞凝集素（Tartary Buckwheat Lectin,TBL）是一类兼具核糖体失活蛋白N-糖苷酶活性和芦丁水解酶活性的糖蛋白,具有显著的靶向抑制结肠癌细胞增殖的功能。先前的研究表明,TBL可以通过下调miR-135a＆b的表达,从而使miR-135a＆b失去对其靶基因APC的抑制,提高APC蛋白的表达量,对Wnt/b-catenin信号通路产生抑制,从而抑制结肠癌细胞的增殖。通过miRNA筛查,我们发现TBL可以下调或者上调诸多miRNA的表达,其中对miR-21的下调最为显著。miR-21是典型的癌miRNA,在目前发现的多种肿瘤细胞中均表现为上调。本研究以miR-21为线索,通过双荧光素酶实验发现PTEN基因是miR-21的靶基因之一,使用TBL处理后,可以缓解miR-21对PTEN基因的抑制。在qRT-PCR实验中,我们发现TBL可以上调PTEN以及PTEN下游AKT m RNA的水平,下调PI3K p110亚基mRNA的水平。通过Western Blot实验表明,使用TBL处理后细胞中的PTEN蛋白显著上调,而AKT蛋白的表达量下调。细胞周期检测发现,TBL可以上调G1期细胞含量,下调S期和G2期的细胞含量。通过伤口愈合实验,我们发现TBL可以显著抑制人结直肠癌细胞HCT116的迁移。上述实验结果表明,来自苦荞麦中的凝集素TBL抑制人结直肠癌细胞HCT116的一个可能机制是通过下调miR-21的表达,上调其靶基因PTEN,进而抑制PI3K/AKT信号通路,阻滞细胞周期的进行以及抑制细胞的迁移能力。本实验内容对深入开展生物活性物质在抗癌、抑癌中的作用方式,揭示相关的作用机理具有重要的价值。

关键词：苦荞凝集素 miR-21 PTEN/PI3K/AKT信号通路细胞周期迁移能力

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苦荞凝集素的纯化及性质鉴定

苦荞凝集素的纯化及性质鉴定

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作者：申剑山西大学

学位级别：硕士

荞麦是一种重要的蓼科杂粮作物,也是一种传统的药食同源植物。苦荞麦种子中蛋白质种类非常丰富,如,蛋白酶抑制剂及特异性抗原的研究已取得长足进展。近年来,凝集素由于其在生物识别、癌症、免疫应答等领域的各项成就,成为生物研究的新... 详细信息

荞麦是一种重要的蓼科杂粮作物,也是一种传统的药食同源植物。苦荞麦种子中蛋白质种类非常丰富,如,蛋白酶抑制剂及特异性抗原的研究已取得长足进展。近年来,凝集素由于其在生物识别、癌症、免疫应答等领域的各项成就,成为生物研究的新标杆。但有关荞麦中的更多生物活性成分,包括凝集素及其在植物源凝集素中的分类、功能等的研究还有待揭示。本文从云南苦荞种子中提纯出一种分子量为62 kDa的蛋白。并对其进行了一些性质及功能的鉴定。利用缓冲液浸提、硫酸铵沉淀、透析及DEAEFF层析等方法纯化苦荞凝集素;PAS(高碘酸-希夫)染色鉴定其蛋白种类,硫酸-苯酚法测定其糖含量;凝血实验和糖抑制实验检测其凝血活性和结合糖特异性;以pNPP(对硝基苯磷酸二钠)和几丁质为底物,分别测定其磷酸酯酶和几丁质酶活性;采用邻苯三酚自氧化法检测其SOD酶活性;以质粒DNA为底物,检测其切割质粒DNA活性;体外翻译抑制实验研究其对蛋白质翻译系统的影响;不同温度和pH对其磷酸酯酶活性的影响;利用HPLC和荧光光谱分析不同金属离子对其酶活性和结构的影响。实验结果表明,采用上述方法纯化的蛋白质是一种具有凝血功能的苦荞凝集素(TBL)。根据SDS-PAGE计算其相对分子质量约为62 kDa。PAS染色证明TBL为糖蛋白或糖结合蛋白,含糖量为5.8%。凝血实验表明TBL能特异性地凝集人的O型血红细胞,效价为15μg/mL,对其它血型的红细胞凝血效应不明显。糖抑制实验表明其血凝活性被D-甘露糖和D-葡萄糖抑制,推测其是一种甘露糖结合凝集素。酶学性质鉴定显示,TBL具有磷酸酯酶活性(米氏常数Km=9.86×10-3 mol/L)和几丁质酶活性(比活力为1.38U/mg)。以质粒为底物,发现TBL具有切割质粒DNA的活性。体外翻译抑制实验表明TBL能够阻止蛋白质的合成。HPLC研究表明,Mn2+对TBL的O-糖苷水解酶活性有促进作用,而Cu2+对其酶活性有抑制作用。凝集素在抗病、抑菌,抗癌及调节免疫活性等方面具有独特的作用。本论文首次获得一种具有酶性功能的苦荞麦凝集素,该凝集素兼具O-糖苷酶和N-糖苷酶活性,并能够切割质粒DNA及抑制蛋白质合成。通过功能分析及与已报道的几种植物源凝集素比对,推断TBL属于凝集素家族中的Ⅱ型核糖体失活蛋白。这些实验结果为深入研究TBL的功能及应用提供了理论基础。

关键词：苦荞凝集素糖蛋白酶学功能 HPLC 荧光光谱

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快速检测核糖体失活蛋白活性质粒的构建及应用

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中国生物化学与分子生物学报 2016年第1期32卷 49-55页

作者：吕彦崔晓东李玉英王转花山西大学生物技术研究所化学生物学与分子工程教育部重点实验室太原030006

核糖体失活蛋白专一地断裂28S rRNA第4 324位的腺嘌呤与核糖之间的N-糖苷键,具有特异破坏核糖体的结构,抑制蛋白质生物合成的功能。核糖体失活蛋白在医疗方面有极大的应用价值。为了能简单快速筛选出核糖体失活蛋白,本实验构建了一种包... 详细信息

核糖体失活蛋白专一地断裂28S rRNA第4 324位的腺嘌呤与核糖之间的N-糖苷键,具有特异破坏核糖体的结构,抑制蛋白质生物合成的功能。核糖体失活蛋白在医疗方面有极大的应用价值。为了能简单快速筛选出核糖体失活蛋白,本实验构建了一种包含核糖体失活蛋白识别位点的双荧光素酶质粒psiCHECK^(TM)-2-F28RNA。用具有N-糖苷酶活性的苦荞凝集素(tartary buckwheat lectin,TBL)作用于psiCHECK^(TM)-2-F28RNA质粒,电泳检测发现,TBL可以将质粒DNA由超螺旋型切割为缺刻型。将psiCHECK^(TM)-2-F28RNA转染HCT116细胞,发现海肾/萤火虫荧光比值也明显降低,表明构建的质粒可以用于检测核糖体失活蛋白对细胞的毒性作用。当将psiCHECK^(TM)-2-F28RNA中的GAGA序列中腺嘌呤分别突变后进行同样实验,确定该质粒中的GAGA为核糖体失活蛋白的识别位点。进一步构建包含GAGA特征序列的Wnt1-3'UTR区的质粒psiCHECK^(TM)-2-Wnt1-3'UTR,实验也发现,在胞外和胞内TBL与psiCHECK^(TM)-2-Wnt1-3'UTR都具有相互作用,表明细胞内具有GAGA序列的m RNA也可能成为核糖体失活蛋白的靶点。选用几种食源性作物中提取的蛋白质,分别与psiCHECK^(TM)-2-F28RNA作用,进行体外检测,结果显示,该质粒能快速地筛选来源于不同生物的核糖体失活蛋白。这些结果表明,本实验构建的psiCHECK^(TM)-2-F28RNA质粒,可用于核糖体失活蛋白的快速筛选和酶活性鉴定。

关键词：核糖体失活蛋白苦荞凝集素 28SrRNA GAGA特征序列 mRNA

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TBL通过下调miR-135a＆b的表达抑制结肠癌细胞增殖的研究

TBL通过下调miR-135a＆b的表达抑制结肠癌细胞增殖的研究

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作者：贾乔瑾山西大学

学位级别：硕士

MicroRNAs （miRNAs）作为内源性的具有调控功能的非编码RNA在肿瘤发生、发展过程中起着非常重要的作用,其有望成为肿瘤治疗的靶标。研究外源物质的抗癌活性及其与miRNAs的协调作用可为癌症、病毒感染等多种疾病提供新的治疗途径。本文... 详细信息

MicroRNAs （miRNAs）作为内源性的具有调控功能的非编码RNA在肿瘤发生、发展过程中起着非常重要的作用,其有望成为肿瘤治疗的靶标。研究外源物质的抗癌活性及其与miRNAs的协调作用可为癌症、病毒感染等多种疾病提供新的治疗途径。本文以苦荞麦中的一种新蛋白——苦荞凝集素（tatary buckwheat lectin, TBL）为材料,对其抗癌机制进行了初步研究。MTT法检测不同浓度的TBL分别作用于11种细胞系后不同细胞系的增殖情况,并用倒置显微镜观察TBL对HCT116细胞形态的影响;DAPI染色法和流式细胞术检测TBL对HCT116细胞凋亡的影响;兔网织红细胞裂解系统和荧光素酶检测系统检测TBL与RNA的相互作用及蛋白质合成抑制作用;qRT-PCR方法分析TBL处理后,HCT116细胞系中19种miRNAs的表达情况;双荧光素酶报告系统检测TBL对miR-135a＆b的靶基因APC （adenomatous polyposis coli, APC）表达水平的调控;Western Blot方法检测TBL对HCT116细胞中Wnt信号通路的几种关键蛋白表达水平的影响。实验结果显示,TBL对结肠癌细胞系HCT116、DLD-1、SW480的增殖有显著且特异的抑制作用,且存在剂量依赖效应,而对正常肝细胞HL7702和正常肠细胞FHC以及其他几种癌细胞的增殖无明显影响;TBL处理HCT116细胞后,存活细胞数量明显减少,体积增大,且细胞核变大,但核周围没有出现典型的凋亡小体,早期凋亡无明显变化,说明TBL没有诱发HCT116细胞凋亡,而可能是另一种形式的细胞死亡。TBL是一种非典型的Ⅱ型核糖体失活蛋白,具有N-糖苷酶活性及抑制蛋白合成的活性;TBL可下调6种致癌miRNAs （miR-21、miR-135a、miR-135b、 miR-17-5p、miR-331和miR-183）的表达,并可通过下调miR-135a＆b的水平促进miR-135a＆b的靶基因APC的表达,进而抑制HCT116细胞中的Wnt信号通路。综上所述,TBL是一种非典型的特异性强且毒性较低的Ⅱ型核糖体失活蛋白（type II ribosome-inactivating protein, II-RIP）类凝集素,它以非凋亡的方式特异的抑制肠癌细胞的增殖;TBL可通过下调miR-135a＆b的水平促进miR-135a＆b的靶基因APC的表达,进而抑制HCT116细胞中的Wnt信号通路水平。这些结果为天然提取物的抗癌活性研究提供新的证据和思路。

关键词：苦荞凝集素肠癌细胞抗癌作用 miRNAs miR-135a＆b

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