苦荞凝集素的纯化及性质鉴定

作     者：申剑 

作者单位：山西大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王转花

授予年度：2015年

学科分类：0710[理学-生物学] 071001[理学-植物学] 07[理学] 

主      题：苦荞凝集素 糖蛋白 酶学功能 HPLC 荧光光谱 

摘      要：荞麦是一种重要的蓼科杂粮作物,也是一种传统的药食同源植物。苦荞麦种子中蛋白质种类非常丰富,如,蛋白酶抑制剂及特异性抗原的研究已取得长足进展。近年来,凝集素由于其在生物识别、癌症、免疫应答等领域的各项成就,成为生物研究的新标杆。但有关荞麦中的更多生物活性成分,包括凝集素及其在植物源凝集素中的分类、功能等的研究还有待揭示。本文从云南苦荞种子中提纯出一种分子量为62 kDa的蛋白。并对其进行了一些性质及功能的鉴定。利用缓冲液浸提、硫酸铵沉淀、透析及DEAEFF层析等方法纯化苦荞凝集素;PAS(高碘酸-希夫)染色鉴定其蛋白种类,硫酸-苯酚法测定其糖含量;凝血实验和糖抑制实验检测其凝血活性和结合糖特异性;以pNPP(对硝基苯磷酸二钠)和几丁质为底物,分别测定其磷酸酯酶和几丁质酶活性;采用邻苯三酚自氧化法检测其SOD酶活性;以质粒DNA为底物,检测其切割质粒DNA活性;体外翻译抑制实验研究其对蛋白质翻译系统的影响;不同温度和pH对其磷酸酯酶活性的影响;利用HPLC和荧光光谱分析不同金属离子对其酶活性和结构的影响。实验结果表明,采用上述方法纯化的蛋白质是一种具有凝血功能的苦荞凝集素(TBL)。根据SDS-PAGE计算其相对分子质量约为62 kDa。PAS染色证明TBL为糖蛋白或糖结合蛋白,含糖量为5.8%。凝血实验表明TBL能特异性地凝集人的O型血红细胞,效价为15μg/mL,对其它血型的红细胞凝血效应不明显。糖抑制实验表明其血凝活性被D-甘露糖和D-葡萄糖抑制,推测其是一种甘露糖结合凝集素。酶学性质鉴定显示,TBL具有磷酸酯酶活性(米氏常数Km=9.86×10-3 mol/L)和几丁质酶活性(比活力为1.38U/mg)。以质粒为底物,发现TBL具有切割质粒DNA的活性。体外翻译抑制实验表明TBL能够阻止蛋白质的合成。HPLC研究表明,Mn2+对TBL的O-糖苷水解酶活性有促进作用,而Cu2+对其酶活性有抑制作用。凝集素在抗病、抑菌,抗癌及调节免疫活性等方面具有独特的作用。本论文首次获得一种具有酶性功能的苦荞麦凝集素,该凝集素兼具O-糖苷酶和N-糖苷酶活性,并能够切割质粒DNA及抑制蛋白质合成。通过功能分析及与已报道的几种植物源凝集素比对,推断TBL属于凝集素家族中的Ⅱ型核糖体失活蛋白。这些实验结果为深入研究TBL的功能及应用提供了理论基础。