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节瘤拟杆菌早期鉴别诊断—PCR检测方法的建立与应用

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节瘤拟杆菌早期鉴别诊断—PCR检测方法的建立与应用

作者：邵西群中国农业科学院

学位级别：硕士

腐蹄病是危害反刍动物养殖业发展的重要疾病之一,瘤拟杆菌(***)是引起牛、羊、鹿等反刍动物腐蹄病的原发性病原菌,为指导疫苗预防需要建立***的早期鉴别诊断技术。本研究根据节瘤拟杆菌特有保守序列设计引物,利用聚合酶链式反应(PCR)建... 详细信息

腐蹄病是危害反刍动物养殖业发展的重要疾病之一,瘤拟杆菌(***)是引起牛、羊、鹿等反刍动物腐蹄病的原发性病原菌,为指导疫苗预防需要建立***的早期鉴别诊断技术。本研究根据节瘤拟杆菌特有保守序列设计引物,利用聚合酶链式反应(PCR)建立了一种简单区分该菌菌群的检测方法。(1)比对纤毛蛋白基因相关序列,依据Ⅰ,Ⅱ菌群的保守序列,设计了可区分两大菌群的三条引物,其中上游引物共用,下游引物分别对两大菌群特异。(2)对可能影响PCR反应的一系列因素进行了较详细的研究,选择了适宜PCR反应的快捷处理病样及血样获得反应模板的方法:病样离心分离细菌,2TE—1%TritonX—100煮沸裂解细菌,离心取上清作模板;用EDTA抗凝血样,温和裂解红细胞,离心沉淀细菌,以后操作同病样处理。对PCR反应条件进行了优化:选3个因素Mg、引物、Taq酶,各3个水平,9个反应组合,选出最佳反应条件,95℃2分钟;94℃35秒,60℃30～40秒,70℃30～35秒,35个循环:70℃5分钟。25ul,30ul,50ul反应体系:MgSO0.2—0.25mM,引物0.2—0.3um,Taq酶1.5—1.75U(50ul体系),1U(30ul体系),0.8U(25ul体系),PCR反应体系用带有(NH)SO的反应缓冲液。灵敏度最高可检测30个菌/30ul反应体系。(3)验证引物特异性试验:设计用鹿、牛、羊等健康群体的环境存在菌(鲜粪,圈泥及其MEB厌氧,有氧培养物)制备模板扩增,用鹿、牛、羊等健康血样制备基因组核酸作模板扩增,及以上模板同时掺入已知节瘤拟杆菌基因组核酸,观察到掺入的扩增阳性,未掺入的直接用上述模板扩增阴性,重复实验,结果一致,证明引物对节瘤拟杆菌是特异的。(4)PCR方法用于病样的检测,共有16个临床病样扩增阳性,其余样品扩增阴性,重复PCR实验,扩增结果一致。向阴性反应体系掺入节瘤拟杆菌基因组核酸,掺入扩增阳性;20份临床病样中13份直接PCR阳性,病样培养物PCR阳性11例与病样直接PCR阳性结果吻合;病样涂片镜检疑有***病样11例与病样直接PCR阳性结果吻合,表明PCR方法检出符合率高。临床病样检测发现采自趾叉皮炎的16份病样与病样直接PCR检测阳性吻合,趾叉皮炎是腐蹄病的初期感染症状,表明PCR检测方法适宜腐蹄病的早期诊断;用病样对应血清与纤毛抗原琼扩实验,健康动物存在该菌的抗体,表明通过检测血清抗体间接确定抗原的血清学方法受抗体产生消退延迟影响不能区分曾经感染和当前感染的菌型。此外发现制约PCR直接检测临床病样的限制因素是病样中细菌外的抑制物,采样部位及病样处理直接影响PCR对目标菌的检出率。为进一步验证扩增条带为目标菌序列片段,采用PCR特异扩增条带测序验证,节瘤拟杆菌扩增产物和病样扩增阳性产物测序显示,扩增产物序列一致。在保证病原采集质量,防止实验操作中交叉污染情况下,本实验建立的PCR检测方法,一次实验还可区分Ⅰ、Ⅱ血清群。可实现对临床初期感染病样中节瘤拟杆菌快速、灵敏、准确的直接检测。

关键词：节瘤拟杆菌 PCR早期诊断腐蹄病

腐蹄病节瘤拟杆菌纤毛蛋白与绵羊白细胞介素-2融合基因表达载体的构建及表达

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中国兽医学报 2002年第2期22卷 131-133页

作者：王克坚 Om Dhungyel 余兴龙冯书章赵宝华 JR Egerton 朱平殷震中国农业科学院吉林特产研究所吉林吉林市132109 澳大利亚悉尼大学解放军军需大学军事兽医研究所吉林长春130062

根据腐蹄病节瘤拟杆菌纤毛蛋白基因 (Pili基因 )序列 ,在 Pili基因 6 19bp Ehe 酶切位点上插入绵羊白细胞介素 - 2基因 (Ovi IL- 2基因 ) ,构建了 Pili基因与 Ovi IL- 2基因的融合基因表达载体。先用 Eco R 、Bam H 双酶切p Bluescript-... 详细信息

根据腐蹄病节瘤拟杆菌纤毛蛋白基因 (Pili基因 )序列 ,在 Pili基因 6 19bp Ehe 酶切位点上插入绵羊白细胞介素 - 2基因 (Ovi IL- 2基因 ) ,构建了 Pili基因与 Ovi IL- 2基因的融合基因表达载体。先用 Eco R 、Bam H 双酶切p Bluescript- Ovi IL - 2重组质粒 ,获得两端具有 Eco R 、Bam H 位点的 Ovi IL - 2基因片段 ,用 Klenow补平后 ,与经Ehe 酶切后的重组质粒 PME2 90 - Pili进行平端连接 ;转化 JM10 5感受态细胞 ,筛选阳性克隆 ,分别用 Bam H 、Eco R 、Xba 、Bgl 、Pvu 等进行酶切鉴定。然后将阳性重组质粒转染 BL - 2 1表达宿主感受态细胞 ,用 0 .1m ol/ L Mg Cl2沉淀法和超声波裂解法提取 BL- 2 1表达 Pili基因与 Ovi IL- 2基因融合基因表达蛋白。对流免疫电泳对重组融合蛋白的特异性分析证明 ,融合蛋白主要在宿主菌体中表达 ;SDS- PAGE电泳结果表明 ,重组融合蛋白分子大小约为 330 0 0 ,表达产物的量约占菌体的 5 .49%。

关键词：腐蹄病节瘤拟杆菌纤毛蛋白基因绵羊白细胞介素2基因基因工程疫苗免疫

鹿腐蹄病A型节瘤拟杆菌纤毛蛋白与绵羊IL－2融合基因表达载体的构建与表达

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鹿腐蹄病A型节瘤拟杆菌纤毛蛋白与绵羊IL－2融合基因表达载体的构...

作者：张洪涛中国农业科学院

学位级别：硕士

A型节瘤拟杆菌是引起鹿、牛、羊等反刍动物腐蹄病的主要菌型之一。菌体纤毛蛋白是其主要保护性抗原。白细胞介素2(IL-2)在特异性免疫应答中起主要作用，能促进T、B淋巴细胞的增殖和分化。已有很多实验证明IL-2作为佐剂能提高体液免疫和... 详细信息

A型节瘤拟杆菌是引起鹿、牛、羊等反刍动物腐蹄病的主要菌型之一。菌体纤毛蛋白是其主要保护性抗原。白细胞介素2(IL-2)在特异性免疫应答中起主要作用，能促进T、B淋巴细胞的增殖和分化。已有很多实验证明IL-2作为佐剂能提高体液免疫和细胞介导的免疫反应。本项研究构建了A型节瘤拟杆菌纤毛蛋白和绵羊IL-2融合基因表达载体;以绿脓杆菌为宿主菌，表达了融合基因蛋白，并可在培养上清中提取;为观察绵羊IL-2在融合基因蛋白中对免疫反应的影响，以及研制生产简便、成本低的A型节瘤拟杆菌纤毛蛋白与IL-2融合基因疫苗打下了基础。研究内容如下：用革兰氏阴性杆菌DNA快速提取法提取A型节瘤拟杆菌染色体DNA，通过PCR技术，扩增出了0.78kb的纤毛蛋白基因。PCR扩增片段与T-Easy载体连接构建了重组TE质粒，并通过EcoRV/SalⅠ双酶切，筛选出正向插入质粒(TE-Pili)进行序列测定。结果正确。将本实验室构建的pBluescript-IL-2质粒用BamHI/EcoRⅤ双酶切，将切出的0.5kb的IL-2基因片段回收，补平。在TE-Pili载体末端的EcoRⅤ位点，插入IL-2基因，并通过EcoRⅠ酶切鉴定出正向插入质粒。大量扩增融合基因(Pili-IL-2)质粒，回收SacⅡ//SalⅠ酶切出的1.28kb Pilin-IL-2基因片段，补平，插入到HpaⅠ酶切的PPL-λ质粒中，分别用SalⅠ/Xboal，AatⅡ/Xbal双酶切，鉴定出正向插入质粒。扩增此质粒，回收BamHⅠ切出的2.5kb的基因片段，与PME290(BamHⅠ酶切后去磷酸化)载体连接。构建出融合基因表达载体，转化绿脓杆菌，获得了A型节瘤拟杆菌纤毛蛋白与IL-2融合基因工程菌株。将融合基因工程菌株在营养肉汤中培养，离心后上清用0.1M MgCl沉淀，离心，提取表达产物。经SDS-PAGE电泳证明表达产物为纤毛蛋白与IL-2的融合蛋白。对流免疫电泳和Western-blot实验证明融合蛋白具有纤毛蛋白特异性。利用提取的表达产物进行家兔免疫实验，结果表明该产物具有免疫原性。

关键词：腐蹄病节瘤拟杆菌纤毛蛋白白细胞介素2 融合Pili-IL-2基因

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节瘤拟杆菌PCR检测方法的初步应用

特产研究 2006年第4期28卷 4-7,10页

作者：邵西群王克坚陈立志杨福合闫庆友中国农业科学院特产研究所吉林吉林132109 厦门大学福建厦门361005 建三江前锋农场黑龙江建三江156325

本研究在建立节瘤拟杆菌PCR检测方法的基础上,将PCR方法用于临床样品的检测。PCR检测发现制约PCR直接检测临床样品检出率的主要因素是临床样品中细菌外的抑制物;采自趾叉皮炎的临床样品16份PCR检测呈阳性,趾叉皮炎是腐蹄病的初期感染症... 详细信息

本研究在建立节瘤拟杆菌PCR检测方法的基础上,将PCR方法用于临床样品的检测。PCR检测发现制约PCR直接检测临床样品检出率的主要因素是临床样品中细菌外的抑制物;采自趾叉皮炎的临床样品16份PCR检测呈阳性,趾叉皮炎是腐蹄病的初期感染症状;而其它蹄病后期症状临床样品PCR检测均为阴性,表明PC R检测方法适宜腐蹄病的早期诊断。

关键词：腐蹄病节瘤拟杆菌 PCR检测

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节瘤拟杆菌K-凝集试验方法的建立

经济动物学报 2005年第3期9卷 134-137页

作者：刘晓颖王克波陈立志王克坚张洪涛苗利光中国农业科学院特产研究所吉林132109 山东齐鲁制药厂中国农业科学院特产研究所济南250100

根据节瘤拟杆菌(***)特异的表面抗原———K抗原具有凝集反应的特性,建立了检测抗节瘤拟杆菌抗体的方法———K-凝集试验方法。节瘤拟杆菌液体培养物接种兔,制备节瘤拟杆菌阳性血清;福尔马林灭活肉汤培养物制备抗原,结果表明,该方法使... 详细信息

根据节瘤拟杆菌(***)特异的表面抗原———K抗原具有凝集反应的特性,建立了检测抗节瘤拟杆菌抗体的方法———K-凝集试验方法。节瘤拟杆菌液体培养物接种兔,制备节瘤拟杆菌阳性血清;福尔马林灭活肉汤培养物制备抗原,结果表明,该方法使用方便、特异性强。

关键词：节瘤拟杆菌 K-凝集试验方法抗体

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节瘤拟杆菌PCR检测方法的建立

特产研究 2005年第4期27卷 4-8页

作者：邵西群王克坚陈立志杨福合中国农业科学院特产研究所吉林吉林132109 厦门大学福建厦门361005

根据节瘤拟杆菌特有保守序列设计引物,利用聚合酶链式反应(PCR)建立了一种鉴别检测该菌的方法。对可能影响PCR检测结果的一系列因素进行了较详细的研究,选择了适宜PCR检测的快捷处理病样获得反应模板的方法,对PCR反应条件进行了优化,使... 详细信息

根据节瘤拟杆菌特有保守序列设计引物,利用聚合酶链式反应(PCR)建立了一种鉴别检测该菌的方法。对可能影响PCR检测结果的一系列因素进行了较详细的研究,选择了适宜PCR检测的快捷处理病样获得反应模板的方法,对PCR反应条件进行了优化,使对已知菌株培养物检测灵敏性最高可到30个菌/30μL反应体系;用广泛的相关菌株和菌群验证引物的特异性,证明设计的引物特异性强。将PCR方法用于临床病样的初步检测,部分病样PCR检测阳性。为用PCR方法检测节瘤拟杆菌引发的牛、羊、鹿腐蹄病奠定了基础。

关键词：腐蹄病节瘤拟杆菌 PCR检测

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腐蹄病节瘤拟杆菌的分子致病机制的研究进展

畜牧兽医杂志 2006年第6期25卷 33-35页

作者：李林吕占军董婧王洪斌东北农业大学黑龙江哈尔滨150030

腐蹄病是反刍动物绵羊、山羊、鹿和奶牛等常见的一种高度接触性传染病。节瘤拟杆菌是致病作用的主要病菌之一,它是通过IV型纤毛和细胞外蛋白酶而产生作用。但从腐蹄病发病症状看,节瘤拟杆菌所致疾病的严重程度不是相同的,据此节瘤拟杆... 详细信息

腐蹄病是反刍动物绵羊、山羊、鹿和奶牛等常见的一种高度接触性传染病。节瘤拟杆菌是致病作用的主要病菌之一,它是通过IV型纤毛和细胞外蛋白酶而产生作用。但从腐蹄病发病症状看,节瘤拟杆菌所致疾病的严重程度不是相同的,据此节瘤拟杆菌被分为毒性、弱毒性和良性菌,这种分类通过对该菌基因组毒性关联蛋白Vap(Virulence-associated protein)区域和毒性相关位点vrl(Virulence Related Locus)区域的研究,发现其致病特点与基因的顺序有很大联系。

关键词：节瘤拟杆菌 Ⅳ型纤毛细胞外蛋白酶 Vap vrl

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一种适宜节瘤拟杆菌生长的改良液体培养基

特产研究 2000年第1期22卷 48-49页

作者：刘晓颖王克坚陈立志苗立光张洪涛中国农业科学院特产研究所吉林132109

反刍动物腐蹄病是危害畜牧业发展的一种严重传染病,其病原节瘤拟杆菌是一种严格厌氧菌.因其生长要求条件高,给培养带来很大困难,原来所用液体培养基细菌生长量少,很难达到增菌及疫苗生产所需的细菌浓度.为此,我们在原来使用培养基(EY液... 详细信息

反刍动物腐蹄病是危害畜牧业发展的一种严重传染病,其病原节瘤拟杆菌是一种严格厌氧菌.因其生长要求条件高,给培养带来很大困难,原来所用液体培养基细菌生长量少,很难达到增菌及疫苗生产所需的细菌浓度.为此,我们在原来使用培养基(EY液体培养基)的基础上,改良制作了一种新的液体培养基--MEB培养基,经过多次试验表明,节瘤拟杆菌在该液体培养基中生长速度较快,菌数是原来液体培养基10倍左右.该液体培养基为节瘤拟杆菌的培养,增菌节约了大量人力物力,是一种值得应用的液体培养基,现将结果报告如下.

关键词：节瘤拟杆菌反刍动物腐蹄病液体培养基

弹性硬蛋白溶解试验鉴别反刍动物腐蹄病节瘤拟杆菌强毒株

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经济动物学报 1999年第2期 57-60页

作者：王克坚陈立志刘晓颖徐敏苗立光中国农科院特产研究所吉林农垦高等专科学校

根据腐蹄病节瘤拟杆菌毒力菌株具有溶解弹性硬蛋白的特性，利用弹性硬蛋白培养基建立了弹性硬蛋白溶解试验，以鉴别节瘤拟杆菌强毒株。试验表明，将不同毒力的菌株同时接种于弹性硬蛋白培养基，蛋白溶解带出现的时间和宽度都显著不同，... 详细信息

根据腐蹄病节瘤拟杆菌毒力菌株具有溶解弹性硬蛋白的特性，利用弹性硬蛋白培养基建立了弹性硬蛋白溶解试验，以鉴别节瘤拟杆菌强毒株。试验表明，将不同毒力的菌株同时接种于弹性硬蛋白培养基，蛋白溶解带出现的时间和宽度都显著不同，强毒株大多在７ｄ内，少部分在７～１１ｄ内均出现一条明显的蛋白溶解带；而弱毒株在２１ｄ内基本上未见蛋白溶解带出现。

关键词：腐蹄病节瘤拟杆菌弹性硬蛋白