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脱落乳牙干细胞细胞外基质神经支架对施万细胞迁移和修复表型影响的体外研究

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脱落乳牙干细胞细胞外基质神经支架对施万细胞迁移和修复表型影响...

作者：杨蕾中国医科大学

学位级别：硕士

目的:仿生型神经支架能够模拟外周神经组织结构或生物活性成分,是替代自体神经移植治疗离断型外周神经损伤(peripheral nerve transection,PNT)的新策略。细胞外基质(extracellular matrix,ECM)富含细胞特异性活性物质,构成细胞和组织... 详细信息

目的:仿生型神经支架能够模拟外周神经组织结构或生物活性成分,是替代自体神经移植治疗离断型外周神经损伤(peripheral nerve transection,PNT)的新策略。细胞外基质(extracellular matrix,ECM)富含细胞特异性活性物质,构成细胞和组织赖以生存的微环境,对组织发育和再生修复具有重要调控功能,亦是一种极具应用前景的天然生物支架材料。脱落乳牙干细胞(stem cells from exfoliated deciduous teeth,SHED)是来源于胚胎神经嵴的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),与神经组织高度同源,富含发育早期和神经相关的生物信号。课题组前期研究表明,脱落乳牙干细胞细胞外基质神经支架(neural scaffold of extracellular matrix derived from stem cells from exfoliated deciduous teeth,SHED-ECMNS)能够促进大鼠坐骨神经离断型损伤后神经再生,但其治疗机制尚不清楚。施万细胞(Schwann cells,SCs)是外周神经系统最主要的神经胶质细胞,形成髓鞘结构,营养支持神经元。外周神经损伤时,SCs脱髓鞘、迁移形成神经桥引导轴突延伸,同时分泌神经营养因子提供营养支持,在一定程度上决定外周神经再生结果。本研究旨在探究SHED-ECMNS对SCs迁移能力和修复表型转化的影响,为揭示SHED-ECMNS促进外周神经再生的机理提供实验依据和理论基础。研究方法:1、酶消化法分离培养SHED并鉴定。细胞聚合体技术制备条索形SHED聚合体(cell aggregate of stem cells from exfoliated deciduous teeth,SHED-CA),脱细胞处理获得SHED-ECMNS。DAPI免疫荧光染色和琼脂糖凝胶电泳检测SHED-ECMNS中细胞核和DNA残留情况,H&E染色和扫描电镜观察SHED-ECMNS组织结构。2、提取新生大鼠坐骨神经,胶原酶和胰酶双酶消化法分离培养大鼠SCs,阿糖胞苷处理纯化培养后,s100免疫荧光染色鉴定细胞。3、SHED-ECMNS与SCs直接接触培养,MTT实验检测SCs活性;扫描电镜观察SCs附着情况。DAPI免疫荧光染色观察SCs在SHED-ECMNS上迁移情况。4、根据国际标准ISO 10993-12,制备SHED-ECMNS浸提液,配制SHED-ECMNS培养基。应用SHED-ECMNS培养基处理SCs,以常规培养SCs作对照组。MTT实验和Ki-67免疫荧光染色检测SCs增殖能力;细胞划痕实验和Transwell实验检测SCs迁移能力;Western Blot和免疫荧光染色检测SCs修复表型相关蛋白c-Jun和Sox2表达水平,Western Blot检测SCs中神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)和神经生长因子(nerve growth factor,NGF)表达水平。5、实验数据以均数±标准差表示,采用SPSS 22.0软件进行统计学分析,符合正态分布的两样本比较采用独立样本t检验,不符合正态分布则使用非参数检验。检验水准α=0.05,P干细胞表面标记物。成功制备SHED-ECMNS,未见明显细胞核结构,DNA基本无残留,组织结构均一,保留大量细胞外基质。2、成功分离培养SCs,细胞呈纺锤形,伸出2-3极分支状突起,外周神经胶质细胞标志蛋白s100阳性表达。3、SHED-ECMNS与SCs直接接触培养,扫描电镜观察可见SCs在SHED-ECMNS表面紧密附着,生长良好,伸出纤长的细胞突起;MTT实验结果显示SCs在第1 d、2 d、3 d细胞相对增殖率均超过80%。免疫荧光染色观察SCs沿SHED-ECMNS表面向支架远端迁移,同时随培养时间增加,SCs向支架内部迁移长入。4、与对照组相比,SHED-ECMNS组SCs增殖能力无明显变化(P>0.05),水平向(12 h和24 h:P细胞突起明显伸长,修复表型相关蛋白c-Jun(P<0.001)、Sox2(P<0.01)和神经营养因子BDNF(P<0.01)、NGF(P<0.01)表达水平明显上调。结论:SHED-ECMNS具有良好的生物相容性,SCs在其表面良好附着、生长和迁移,并且SHED-ECMNS能够增强SCs迁移能力,促进

关键词：神经支架脱落乳牙干细胞细胞外基质施万细胞迁移修复表型

脱落乳牙干细胞通过抑制内质网应激反应缓解大鼠三叉神经痛的实验研究

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脱落乳牙干细胞通过抑制内质网应激反应缓解大鼠三叉神经痛的实验...

作者：杨智杰中国医科大学

学位级别：硕士

目的:三叉神经痛（Trigeminal neuralgia,TN）是一种常见的颅内神经病变,作为神经病理性疼痛（Neuropathic pain,NP）的一种类型,它严重影响着患者的身心健康。然而,三叉神经痛的病理机制十分复杂,目前临床上一些传统药物治疗以及手术... 详细信息

目的:三叉神经痛（Trigeminal neuralgia,TN）是一种常见的颅内神经病变,作为神经病理性疼痛（Neuropathic pain,NP）的一种类型,它严重影响着患者的身心健康。然而,三叉神经痛的病理机制十分复杂,目前临床上一些传统药物治疗以及手术治疗方案对疼痛的缓解均存在一定的局限性,所以,针对三叉神经痛的新的治疗方案已成为目前的研究热点。近年来,干细胞相关移植治疗被证实是一种有效的缓解神经病理性疼痛的策略。脱落乳牙干细胞（Stem cells from human exfoliated deciduous teeth,SHED）提取于人脱落的乳牙牙髓,其提取方法简易且无创,不涉及伦理问题。相关研究表明,脱落乳牙干细胞能够缓解大鼠三叉神经痛,但有关其缓解疼痛的具体机制仍不明确。同时现有研究表明干细胞对内质网应激（ER stress）有一定的调控作用,且内质网应激已被证实参与了周围神经病理性疼痛的发生发展。本实验通过压迫性损伤大鼠眶下神经建立动物三叉神经痛模型及体外PC12细胞内质网应激模型进行相关实验研究。在动物实验中,通过局部移植SHED观察大鼠机械疼痛阈值的变化情况;同时检测神经结扎后,三叉神经神经节细胞内内质网形态的变化以及神经周围炎性细胞浸润的变化情况;探究SHED在局部移植后能否调节三叉神经节（Trigeminal ganglion,TG）里内质网应激的标志分子胱天蛋白酶12（Caspase12）和氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）的表达。在体外实验中,通过衣霉素刺激PC12神经元细胞建立体外内质网应激模型,通过SHED与PC12细胞进行共培养的方式明确SHED能否缓解PC12细胞的内质网应激,明确SHED是否能够通过抑制PC12细胞中内质网应激的标志分子重链结合蛋白Bi P来达到减缓内质网应激反应的目的,从而为三叉神经痛的治疗提供新思路。方法:动物实验:1、原代SHED分离培养。2、通过眶下神经结扎方式建立三叉神经痛大鼠模型,测量大鼠机械疼痛阈值。3、观察SHED的局部移植对大鼠机械痛阈的影响,并分别在注射前和注射后3、7、14天的时间点对大鼠的机械疼痛阈值使用Von Frey纤维丝测量。4、观察神经结扎前后TG中内质网形态变化。5、HE染色观察神经结扎前后的周围炎症反应变化。6、检测神经结扎后TG中JNK m RNA水平的变化;Caspase12 m RNA和蛋白水平的变化。7、检测局部SHED移植后TG中JNK m RNA水平的变化;Caspase12 m RNA和蛋白水平的变化。体外细胞实验:1、衣霉素刺激PC12细胞建立体外内质网应激模型后,采用Hoechst 33342/PI双染色在荧光显微镜下观测细胞膜损伤情况。2、检测单纯衣霉素刺激后PC12细胞中Bi P在m RNA水平和蛋白水平的变化。3、检测SHED与PC12共培养后,衣霉素刺激的PC12细胞内Bi P m RNA和蛋白水平的变化。结果:动物实验:1、SHED被成功分离提取,镜下可见细胞呈长梭形贴壁生长。2、大鼠三叉神经痛模型建立成功。相比于假手术组,手术结扎组大鼠机械痛阈数值在术后1、3、7、14天后显著降低（P＜0.01）。3、局部移植SHED后,机械疼痛阈值被逆转。SHED组和PBS组比较,在注射后3、7、14天,机械疼痛阈值显著升高（P＜0.01）。4、相比于假手术组,手术结扎组TG电镜下内质网形态发生明显肿胀。5、与假手术组比较,手术结扎组神经周围有明显的炎性反应。HE染色结果表明对照组大鼠三叉神经结构正常,不伴有炎性细胞浸润;手术结扎组可见炎性细胞浸润明显增加。6、神经结扎后JNK和Caspase12在术侧TG中表达增加。手术结扎组大鼠相比于假手术组在术后14天,JNK m RNA（P=0.001）,Caspase12 m RNA（P=0.006）及Caspase12蛋白（P=0.005）的表达上调。7、局部移植SHED后,JNK和Caspase12的表达在术侧TG中存在逆转现象。SHED移植后14天,JNK m RNA（P=0.004）,Caspase12 m RNA（P=0.001）及Caspase12蛋白（P=0.009）表达被明显抑制。体外细胞学实验:1、Hoechst33342/PI双染法观察细胞形态,TM组细胞膜损伤导致通透性增加,PI则能够穿透细胞膜到达核内,与DNA结合后进而显示红色荧光的阳性细胞增多（P=0.001）,SHED组细胞的胞膜损伤有所减轻,表现为镜下带红色荧光的阳性细胞显著减少（P=0.005）。2、经衣霉素刺激处理的PC12细胞中Bi P m RNA（P=0.033）及Bi P蛋白（P=0.01）的表达水平升高。3、SHED作用于PC12细胞后,经衣霉

关键词：脱落乳牙干细胞内质网应激三叉神经痛胱天蛋白酶12 氨基末端激酶重链结合蛋白

脱落乳牙干细胞缓解大鼠三叉神经痛的初步探索

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脱落乳牙干细胞缓解大鼠三叉神经痛的初步探索

作者：王纯中国医科大学

学位级别：硕士

目的:三叉神经痛是发生于三叉神经支配区域,反复出现的一种突发、剧烈、短暂的神经病理性疼痛,严重影响患者的生活质量。三叉神经痛发病机制复杂,常规药物及外科治疗对于疼痛缓解有限。近年来干细胞为三叉神经痛的治疗提供了新策略。脱... 详细信息

目的:三叉神经痛是发生于三叉神经支配区域,反复出现的一种突发、剧烈、短暂的神经病理性疼痛,严重影响患者的生活质量。三叉神经痛发病机制复杂,常规药物及外科治疗对于疼痛缓解有限。近年来干细胞为三叉神经痛的治疗提供了新策略。脱落乳牙干细胞(Stem cells from human exfoliated deciduous teeth,SHED)是来源于脱落乳牙的牙源性干细胞,获取容易且操作无创,免疫排斥发生率较低。研究表明SHED具有神经保护和免疫调节的作用,对于三叉神经痛具有潜在的治疗作用。本研究建立大鼠眶下神经慢性压迫性损伤三叉神经痛模型;通过局部移植SHED观察大鼠机械疼痛阈值的变化情况;观察SHED移植对结扎神经局部炎性细胞浸润的影响;对局部移植的SHED分布进行示踪;探究SHED局部移植能否调节三叉神经节(Trigeminal ganglion,TG)中CXC趋化因子受体5(C-X-C chemokine receptor 5,CXCR5)和白介素21(interleukin-21,IL-21)的表达,初步探索SHED缓解三叉神经痛的可能机制,为三叉神经痛的治疗提供信息。方法:1、SHED原代分离培养,流式细胞术检测干细胞表面标志物,检测SHED多向分化能力。2、通过眶下神经结扎建立三叉神经痛大鼠模型,术前、术后1、3、5、7天用Von Frey纤维丝测量大鼠机械疼痛阈值。3、观察局部移植SHED对大鼠机械疼痛阈值的影响,注射前、注射后3、5、7天测量大鼠机械疼痛阈值。4、HE染色观察移植SHED前后眶下神经周围炎症反应变化。5、免疫荧光示踪观察局部移植后SHED的分布情况。6、检测神经结扎后TG中CXCR5和IL-21 mRNA的表达变化。7、检测SHED移植后TG中CXCR5和IL-21mRNA的表达变化。结果:1、成功分离提取SHED,细胞呈梭形贴壁生长;流式细胞术检测SHED表达间充质干细胞表面标记物CD73、CD105,不表达造血干细胞表面标记物CD34、CD45,可成神经向及成骨分化。2、大鼠三叉神经痛模型建立成功。与假手术组比较,手术结扎组大鼠术侧机械疼痛阈值在术后1、3、5、7天的显著降低(P细胞浸润;PBS组可见大量炎性细胞浸润;SHED组炎性细胞明显减少。5、免疫荧光显示,SHED局部移植72小时后,在同侧TG组织中检测到荧光标记的SHED。6、神经结扎后CXCR5和IL-21 mRNA在术侧TG中表达增加。与假手术组比较,手术结扎组大鼠术后7天,CXCR5 mRNA(P细胞浸润,抑制TG中CXCR5和IL-21 mRNA的表达上调相关。

关键词：脱落乳牙干细胞三叉神经痛机械疼痛阈值 CXC趋化因子受体5 白介素21

脱落乳牙干细胞通过旁分泌作用于PD-1缓解大鼠三叉神经痛

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脱落乳牙干细胞通过旁分泌作用于PD-1缓解大鼠三叉神经痛

作者：肖可中国医科大学

学位级别：硕士

目的:建立三叉神经眶下神经支-慢性压迫损伤(Chronic constriction injuryinfraorbital nerve,CCI-ION)大鼠模型,观察局部移植脱落乳牙干细胞(SHED,Stem Cells from Human Exfoliated Deciduous Teeth)后CCI-ION大鼠机械疼痛阈值的变化情况;通过注射程序性死亡受体1(Programmed Death protein 1,PD-1)封闭抗体nivolumab,观察封闭PD-1对SHED移植后的CCI-ION大鼠镇痛作用的影响。探究SHED能否通过作用于三叉神经节(Trigeminal ganglion,TG)神经元上PD-1受体调控瞬时受体电位离子通道1(Transient receptor potential A1,TRPA1)和降钙素基因相关肽(Calcitonin Gene-Related Peptide,CGRP)的表达进而影响疼痛。通过构建LPS预处理的人神经母细胞瘤细胞系sh-sy5y与SHED共培养体系,探究transwell小室中的SHED能否通过旁分泌作用于下室sh-sy5y细胞从而调控疼痛感受蛋白TRPA1、CGRP的表达。通过在共培养体系中添加封闭抗体nivolumab或其同型对照抗体Ig G4,探究SHED的旁分泌作用是否以下室细胞的PD-1受体为靶点,从而介导TRPA1、CGRP相关的镇痛作用,为三叉神经痛的干细胞治疗机制研究提供理论基础和实验依据。方法:1、SHED原代分离培养,流式细胞术检测间充质干细胞表面标志物。2、108只SD雄性大鼠按照随机抽样法分为sham组、CCI-ION组、PBS组,SHED组,SHED+Ig G4组,SHED+nivolumab组。sham组仅暴露神经而不行结扎术,CCI-ION组建立大鼠三叉神经痛慢性压迫损伤模型;PBS组于神经结扎后第三天局部注射PBS,SHED组于神经结扎后第三天局部注射SHED;SHED+Ig G4组对CCI-ION大鼠移植SHED后第1、3、5、7天局部注射nivolumab同源对照抗体Ig G4,SHED+nivolumab组对CCI-ION大鼠移植SHED后第1、3、5、7天局部注射PD-1封闭抗体nivolumab。3、用Von Frey纤维丝测量sham组及CCI-ION组大鼠术前、术后1、3、5、7天机械疼痛阈值;测量PBS组和SHED组大鼠结扎术前、SHED移植前、SHED移植后1、3、5、7天机械疼痛阈值;测量Ig G4组和nivolumab组大鼠分别于SHED移植后第1、3、5天注射抗体前、注射后1、3、5、7小时机械疼痛阈值变化。4、q RT-PCR方法检测各组神经结扎后大鼠TG中TRPA1和CGRP m RNA的相对表达量。5、western blot检测各组大鼠TG中TRPA1和CGRP蛋白的相对表达量。6、双重免疫荧光染色验证CGRP、TRPA1在大鼠TG神经元的共定位关系。7、培养sh-sy5y细胞并分为对照组、LPS预处理组、LPS+SHED共培养组、LPS+SHED+nivolumab组、LPS+SHED+Ig G4组。8、western blot检测各组下室的sh-sy5y细胞TRPA1、CGRP的蛋白表达变化。结果:1、SHED提取成功,细胞呈旋涡状排列;流式细胞术鉴定SHED属于间充质干细胞。2、大鼠三叉神经疼痛模型建立成功。与sham组相比,CCI-ION组大鼠术侧机械疼痛阈值在第3、5、7、10天显著降低,差异具有统计学意义(P<0.0001)。3、通过与PBS组比较,SHED组大鼠机械疼痛阈值在注射后3、5、7天显著升高(P<0.0001、P=0.0001、P=0.0001)。4、SHED+Ig G4组和SHED+nivolumab组比较,发现SHED移植后第1、3、5天注射nivolumab后1、3小时的机械疼痛阈值与注射Ig G4相比明显降低(SHED移植后第1天:P=0.0028和P=0.0003、SHED移植后第3天:P=0.0007和P=0.0029、SHED移植后第5天:P=0.0023和P=0.0112)。5、组织双重免疫荧光染色结果显示CGRP与TRPA1在大鼠三叉神经节神经元共表达。6、CCI-ION组大鼠相较sham组大鼠的三叉神经节TRPA1、CGRP的m RNA转录水平(分别为:P=0.0021、P=0.0095)和蛋白表达水平(分别为:P=0.0003、P=0.005)均升高。7、SHED下调CCI-ION大鼠TRPA1、CGRP的m RNA转录水平(分别为:P=0.0093、P=0.0125)及蛋白表达水平(分别为:P=0.0009、P=0.0444)。8、nivolumab逆

关键词：脱落乳牙干细胞三叉神经痛机械疼痛阈值 TRPA1 CGRP 三叉神经眶下支结扎 PD-1

仿生型脱落乳牙干细胞细胞外基质复合神经支架的制备和鉴定

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仿生型脱落乳牙干细胞细胞外基质复合神经支架的制备和鉴定

作者：杨文箫中国医科大学

学位级别：硕士

目的：设计制备适用于离断型外周神经损伤(peripheral nerve injuries,PNI)治疗的组织工程神经支架是神经再生医学领域的热点问题。细胞外基质(extracellular matrix,ECM)是由细胞分泌到细胞外间质中的大分子物质构成的复杂网架结构,形... 详细信息

目的：设计制备适用于离断型外周神经损伤(peripheral nerve injuries,PNI)治疗的组织工程神经支架是神经再生医学领域的热点问题。细胞外基质(extracellular matrix,ECM)是由细胞分泌到细胞外间质中的大分子物质构成的复杂网架结构,形成细胞生存适宜微环境,在组织发育与再生中发挥关键作用。脱落乳牙干细胞(stem cells from exfoliated deciduous teeth,SHED)来源于胚胎神经嵴组织,与神经组织同源,具有较强成神经类细胞分化的潜能,是神经组织再生领域一种极具应用前景的干细胞源。本课题旨在设计构建SHED细胞聚合体(cell aggregation of stem cells from exfoliated deciduous teeth,SHED-CA)模拟神经内部结构;以静脉外膜模拟神经外膜,脱细胞处理制备仿生型SHED细胞外基质复合神经支架(neural scaffold of extracellular matrix derived from stem cells from exfoliated deciduous teeth,SHEDECMNS),为组织工程神经支架的设计与制备提供新的策略,为SHED-ECMNS应用于PNI再生治疗奠定基础。研究方法：1.酶消化法分离培养原代SHED,成神经、成骨诱导检测多向分化潜能,流式细胞术检测间充质干细胞表面标记物。通过细胞聚合体技术构建管条状SHED-CA,分离提取大鼠股静脉,将SHED-CA与股静脉组装构建SHED细胞聚合体复合神经支架(neural scaffold of cell aggregation of stem cells from exfoliated deciduous teeth,SHED-CANS);使用3%Triton X-100脱细胞处理72 h,制备SHED-ECMNS。***染色、DNA琼脂糖凝胶电泳实验评估SHED-ECMNS脱细胞效果。3.H&E染色及扫描电镜观察SHED-ECMNS组织学及显微结构;吸水实验分析SHED-ECMNS孔隙率及吸水率;免疫荧光染色分析SHED-ECMNS蛋白表达;拉伸实验检测SHED-ECMNS抗拉强度。降解实验分析SHED-ECMNS体外降解率;CCK8实验检测SHED-ECMNS体外细胞毒性。实验数据采用SPSS 22.0软件进行统计学分析,两样本均数比较采用LSD-t检验,P细胞样;成神经诱导后,神经元标记物βIII-Tubulin表达呈阳性;成骨诱导后,茜素红S染色见矿化结节形成;间充质干细胞表面标记物CD73、CD90、CD105阳性表达,造血干细胞表面标记物CD34、CD45阴性表达,符合国际干细胞研究协会制定的干细胞鉴定标准。***染色见SHED-ECMNS中无细胞核结构,仅见微弱DAPI阳性染色物质分散于支架内部;DNA琼脂糖凝胶电泳未见SHED-ECMNS明显DNA条带,证实SHED-ECMNS脱细胞成功。3.H&E染色见SHED-ECMNS为内外双层结构,由致密的静脉外膜包裹内部疏松的SHED细胞外基质(extracellular matrix derived from stem cells from exfoliated deciduous teeth,SHED-ECM)结构,内外部结构之间结合紧密,边缘见明显融合;扫描电镜见SHED-ECMNS外表面呈波浪皱折状,内部结构均质,见大量纵向细小孔隙贯穿于ECM纤维结构间;吸水试验显示SHED-ECMNS孔隙率为64.62±4.73%,吸水率为1370.46±72.71%,其吸水率主要由内部SHED-ECM结构提供;免疫荧光染色显示SHED-ECMNS富含ECM蛋白I型胶原(Collagen I)、纤连蛋白(Fibronectin)且阳性表达神经相关蛋白β微管蛋白III(βIII-Tubulin)、巢蛋白(Nestin);拉伸实验显示SHED-ECMNS极限应力(P细胞神经(acellular nerve,AN)。SHED-ECMNS体外降解体系p H为7.23-6.58,降解速度缓慢,8 w时最大失重率为42.43%;SHED-ECMNS条件培养基处理组细胞相对增殖率均>70%,表明SHED-ECMNS具有较好的生物相容性。结论：采用SHED-ECM与脱细胞静脉(decellularized vein,d Vein)成功构建仿生型SHED-ECMNS,有效模拟外周神经的天然结构,具有适合外周神经再生的显微结构、吸水性能、蛋白成分及抗拉强度

关键词：神经再生支架材料神经仿生脱落乳牙干细胞细胞外基质

干扰素-γ对脱落乳牙干细胞增殖和成骨向分化影响的体外研究

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干扰素-γ对脱落乳牙干细胞增殖和成骨向分化影响的体外研究

作者：戴璐中国医科大学

学位级别：硕士

目的:口腔颌面部外伤、肿瘤、先天畸形等原因可造成颌面部骨组织大面积缺损,严重影响患者的咀嚼功能、发音及外观容貌。以干细胞为基础的组织再生医学,是颌面部骨组织缺损治疗的一个新方向。近年来研究发现,宿主免疫微环境,即免疫细胞... 详细信息

目的:口腔颌面部外伤、肿瘤、先天畸形等原因可造成颌面部骨组织大面积缺损,严重影响患者的咀嚼功能、发音及外观容貌。以干细胞为基础的组织再生医学,是颌面部骨组织缺损治疗的一个新方向。近年来研究发现,宿主免疫微环境,即免疫细胞及其分泌的炎性细胞因子在组织再生过程中发挥了至关重要的作用,其很大程度上调控干细胞的生物学性能,决定组织再生的疗效。前期研究发现促炎症细胞因子干扰素γ(interferon-gamma,IFN-γ)参与调控脱落乳牙干细胞(stem cells from exfoliated deciduous teeth,SHED)体内成骨能力,但具体调控作用未知。本实验拟通过体外细胞实验研究IFN-γ对SHED细胞增殖和成骨向分化的影响,为明确免疫微环境在组织再生中的作用提供依据,为提高以干细胞为基础的骨组织再生疗效寻求新靶点。研究方法:原代分离培养人SHED。流式细胞术检测干细胞表面标记物CD34、CD45、CD73、CD90、CD105的表达,茜素红S、油红O染色和免疫荧光染色等检测其多向分化潜能。用不同浓度的IFN-γ(0、10、50、100、200 ng/mL)处理SHED 3d,CCK8法检测SHED细胞增殖率,流式细胞术及甲苯胺蓝染色检测SHED细胞凋亡比率;用不同浓度的IFN-γ(0、10、50、100、200 ng/mL)预处理SHED后进行成骨诱导,茜素红S染色检测矿化结节形成能力,Western blot检测成骨相关分子Runx2、ALP的蛋白表达水平,评估IFN-γ对SHED成骨能力的影响。实验结果采用SPSS 18.0软件进行统计学分析。结果:IFN-γ能够抑制SHED增殖,可能呈现浓度依赖性,IFN-γ浓度越高抑制SHED增殖效果越明显;高浓度IFN-γ(100、200 ng/mL)可以诱导SHED凋亡;高浓度IFN-γ(100、200 ng/mL)可以抑制SHED成骨向分化。结论:IFN-γ诱导SHED凋亡,抑制其增殖和成骨向分化,从而降低以SHED为基础的骨组织再生疗效。调控宿主免疫微环境是提高以干细胞为基础的骨组织再生疗效新的重要靶点。

关键词：脱落乳牙干细胞免疫微环境干扰素-γ 骨组织再生

牙髓仿生型脱落乳牙干细胞细胞外基质支架促进牙髓-牙本质复合体再生的实验研究

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牙髓仿生型脱落乳牙干细胞细胞外基质支架促进牙髓-牙本质复合体...

作者：杨宁中国医科大学

学位级别：硕士

目的:牙髓再生治疗（regenerative endodontic procedures,REPs）是年轻恒牙牙髓及根尖周病治疗的新策略。根管内不规则钙化（revascularization-associated intracanal calcification,RAIC）是REPs最常见的并发症,然而募集进入根管内的颌骨骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs）非特异性成骨向分化是导致RAIC的主要因素。如何定向诱导BMMSCs成牙本质向分化,促进牙髓-牙本质复合体再生是牙髓再生领域亟待解决的重要问题。脱落乳牙干细胞（stem cells from human exfoliated deciduous teeth,SHED）分离提取于生理性脱落乳牙的牙髓组织,富含牙髓发育信号分子,在牙髓发育和再生中至关重要。细胞外基质（extracellular matrix,ECM）是细胞分泌到细胞外间质的蛋白质和多糖类等大分子物质构建的复杂网架结构,是细胞赖以生存的微环境,对组织再生具有重要调节作用。本课题旨在设计制备牙髓仿生型SHED-ECM支架（extracellular matrix scaffold of stem cells from exfoliated deciduous teeth,SHED-ECMS）,探究其促进牙髓-牙本质复合体再生的疗效。研究方法:1.原代分离培养SHED并鉴定。高浓度维生素C诱导形成SHED细胞膜片,细胞膜片间铺种SHED,将其缠绕于聚四氟乙烯管培养1周,将聚四氟乙烯管抽出后继续培养1周构建牙髓形状的SHED细胞聚合体,3%Triton X-100进行脱细胞处理制备牙髓仿生型SHED-ECMS,进行生物支架表征鉴定。2.根据国际标准ISO 10993-12标准,制备SHED-ECMS条件培养基。检测SHED-ECMS条件培养基对BMMSCs粘附、活性、迁移以及成骨/成牙本质分化能力的影响,以常规培养BMMSCs为对照组。3.构建裸鼠皮下牙根片段移植模型,以SHED-ECMS复合BMMSCs移植为实验组,以单纯BMMSCs移植为对照组,8周后处死动物取材,组织学观察牙根片段内牙髓-牙本质复合体再生情况。4.实验结果采用SPSS 22.0软件包进行统计学分析,两样本均数比较采用t检验,P＜0.05为差异具有统计学意义。结果:SHED-ECMS组织学观察未见明显细胞核结构,DNA成分有效去除,保留了细胞外基质主要结构;细胞外基质主要成分纤维连接蛋白（Fibronectin）、I型胶原蛋白（Collagen I）表达阳性,且高表达成牙本质相关蛋白牙本质基质蛋白-1（dentin matrix protein 1,DMP1）和牙本质涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein,DSPP）。与对照组相比,SHED-ECMS显著增强BMMSCs附着及迁移能力（P＜0.05）,对细胞活性无显著性影响;显著促进BMMSCs矿化结节形成,并特异性上调其DSPP和DMP1蛋白表达水平（P＜0.05）。牙根片段组织学观察:SHED-ECMS组牙根片段根管内充满交织呈网状的牙髓样组织,大量新生血管形成,根管内壁见连续的新生管状牙本质形成,牙本质内侧见高柱状成牙本质细胞样细胞极性排列,细胞胞体深入牙本质小管中,形成牙髓-牙本质复合体结构;而在对照组未见明显新生管状牙本质层及极性排列成牙本质细胞。结论:牙髓仿生型SHED-ECMS具有良好的生物相容性,能够促进BMMSCs细胞粘附、迁移,定向诱导BMMSCs成牙本质向分化,促进牙髓-牙本质复合体再生。本研究为临床上应用SHED-ECMS减少REPs根管钙化并发症提供了实验基础和理论支持。

关键词：牙髓再生治疗牙髓-牙本质复合体脱落乳牙干细胞细胞外基质支架骨髓间充质干细胞成牙本质向分化

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脱落乳牙干细胞治疗神经系统疾病的研究进展

口腔生物医学 2023年第2期14卷 119-122页

作者：郭蓉于金华南京医科大学附属口腔医院牙体牙髓科江苏省口腔疾病研究重点实验室江苏省口腔转化医学工程研究中心江苏南京210029

脱落乳牙干细胞(SHED)是一种神经脊来源的牙源性干细胞,具有神经分化潜能、高度增殖能力、自我更新能力,具有神经再生和神经保护方面作用。本文结合病理特点对SHED及其衍生物在神经退行性和损伤性疾病的治疗作用进行综述。

关键词：脱落乳牙干细胞神经退行性疾病神经损伤

负载脱落乳牙干细胞外泌体的透明质酸可注射水凝胶的制备及其对小鼠牙周炎抗炎成骨的研究

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口腔颌面外科杂志 2023年第5期33卷 292-297页

作者：应乔俞懿强苏俭生同济大学口腔医学院同济大学附属口腔医院口腔修复科上海牙组织修复与再生工程技术研究中心上海200072

目的:制备负载人脱落乳牙干细胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth,SHED)外泌体(exosomes,EXO)的可注射透明质酸(hyaluronic acid,HA)水凝胶,探究其在牙周炎中的抗炎及成骨作用。方法:提取SHED外泌体,以高分子量HA为基质,在其中负载SHED外泌体以合成可注射HA水凝胶(SHED-HA),并测定其降解率。采用CCK-8法分析SHED-HA的生物相容性,应用实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)研究SHED-HA的成骨诱导作用及炎症抑制作用。随后,通过micro-CT来分析SHED-HA对小鼠牙槽骨缺损的挽救作用。结果:6%w/v透明质酸水凝胶具有较合适的降解性。CCK-8结果显示,SHED-HA具有较好的生物相容性能。RT-qPCR结果显示,SHED-HA组炎症基因IL-1β、IL-6的表达水平下调,而成骨分化相关基因Runx2、OPN、OCN的表达水平上调。体内实验显示,SHED-HA能减轻小鼠牙槽骨破坏。结论:成功构建负载了SHED外泌体的HA水凝胶SHED-HA,同时证实了其对小鼠牙周炎具有抗炎、成骨的作用。

关键词：透明质酸脱落乳牙干细胞外泌体成骨分化