脱落乳牙干细胞骨向分化相关分子Runx2动态表达研究

作     者：王立媛 

作者单位：天津医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：贾智

授予年度：2011年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100101[医学-人体解剖与组织胚胎学] 10[医学] 

主      题：脱落乳牙干细胞 骨向分化 Runx2 基因 动态表达 

摘      要：目的： 体外分离、培养人脱落乳牙干细胞(SHEDs),分析其生物学特征,探讨SHEDs骨向分化潜能,分不同时间点观察成骨相关转录因子Runx2的动态表达规律,为研究SHEDs成骨调控因素及其组织再生临床应用提供研究基础。 方法： 依据Miura等的实验方法,选取6～10岁健康儿童因滞留拔除的乳牙,采用酶消化法分离、有限稀释法纯化,获得人脱落乳牙干细胞。观察原代和传代细胞生长、增殖情况,测定细胞克隆形成率,HE染色,观察原代及传代细胞形态学特征。流式细胞仪及细胞免疫荧光染色检测SHEDs表面标志。培养的第3代SHEDs,在体外经含有IBMX、胰岛素、消炎痛和氢化可的松条件培养液,向脂肪组织进行诱导分化,观察细胞形态变化及细胞内形成脂滴情况,4周后油红-O染色。第3代SHEDs,在含有10%胎牛血清、1×10-8mol/1地塞米松、50 mg/lβ-甘油磷酸钠和10mmol/1维生素C的成骨诱导条件培养液诱导3周,观察细胞形态和生长规律的变化,分别于成骨诱导第0天和第21天做茜素红染色,检测矿化结节形成情况,鉴定其成骨分化的生物学特征。于成骨诱导的第0、3、6、9、12、15、18和21天,用RT-PCR技术检测Runx2的动态表达。 结果： 1.通过酶消化法和有限稀释法获得了人脱落乳牙干细胞,原代培养的细胞一般在接种2天后,倒置显微镜下见细胞贴壁生长,形态呈现多形性。随着生长传代,细胞较多的出现多角形、梭形,成纤维细胞样,并且大小趋近一致。原代细胞爬片HE染色,大部分细胞呈梭形,体积较小,轮廓清晰,细胞核为圆形或卵圆形,体积较大。少数细胞内可见多个核仁存在。 2.计算细胞克隆形成率为22-26个/103细胞。流式细胞仪和细胞免疫荧光染色检测细胞表面标志显示,CD146+占总细胞量的92.51±1.34%,STRO-1+占总细胞量的20.01±1.62%。在成脂诱导体系的的作用下,可见个别细胞胞浆内出现高强度的折射点,油红－O染色可见橙红色阳性颗粒。在矿化诱导液的作用下,细胞形态变为多角形,形成钙化结节,经茜素红色呈阳性。 ***-PCR技术检测SHEDs成骨诱导过程中Runx2的动态表达规律显示：0天已有表达,0～6天成明显增强趋势,6～12天显著下降,12～18天表达再次上升,以后相对平稳。 结论： ***可体外分离、培养,表达间充质干细胞表面标志,具有较强的倍增能力及克隆形成能力,具有成脂和成骨向分化能力。 ***2在SHEDs成骨分化过程中成动态表达,成骨分化各阶段均有表达,早期和晚期表达上升,中期表达有下降趋势。