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中华神经外科杂志 2008年第5期24卷 393-397页

作者：刘明永赵建华梁华平吴丹卞修武第三军医大学大坪医院野战外科研究所重庆400042 第三军医大学西南医院病理学研究所

目的研究负载脊髓匀浆蛋白的未成熟树突状细胞（hpDCs）对小鼠脊髓损伤的促修复作用。方法通过局部或腹腔注射hpDCs，并设立对照，利用BBB功能评分及组织病理学方法，观察其对小鼠脊髓损伤神经功能恢复和局部病变范围、空洞大小、胶质... 详细信息

目的研究负载脊髓匀浆蛋白的未成熟树突状细胞（hpDCs）对小鼠脊髓损伤的促修复作用。方法通过局部或腹腔注射hpDCs，并设立对照，利用BBB功能评分及组织病理学方法，观察其对小鼠脊髓损伤神经功能恢复和局部病变范围、空洞大小、胶质瘢痕厚度等病理改变的影响。结果注射后第84天，腹腔注射hpDCs组BBB评分为16．5，与对照组相比有显著统计学意义（P〈0．01）。各组腹腔或局部注射效果无统计学意义（P〉0．05）。同时hpDCs可延长Nestin表达时间，缩小损伤区范围、空洞面积、胶质瘢痕厚度。结论腹腔或局部注射hpDCs均可改善局部环境并促进小鼠脊髓损伤神经功能恢复。

关键词：脊髓损伤树突状细胞脊髓匀浆蛋白

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吴茱萸碱刺激的负载脊髓匀浆蛋白DCs促进小鼠脊髓损伤的修复

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第三军医大学学报 2010年第3期32卷 269-273页

作者：王科赵建华梁华平第三军医大学大坪医院野战外科研究所骨科重庆400042 第三军医大学大坪医院野战外科研究所第一研究室创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室重庆400042

目的探讨吴茱萸碱(evodiamine,EVO)刺激的负载脊髓匀浆蛋白(homogenate protein of spinal cord,hp)树突状细胞(hpDCevo)对小鼠脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)的促修复作用及其机制。方法SCI后24 h给予治疗,随机分6组:分别腹腔注射PBS、EVO、未成熟DC(DCs)、经EVO刺激的DCs(DCevo)、负载hp的DC(hpDC)、hpDCevo。利用BMS功能评分及组织病理学方法,观察hpDCevo对小鼠脊髓损伤神经功能恢复和局部瘢痕等病理学改变的影响。ELISA法测定SCI损伤局部组织和T细胞培养上清中的脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、神经营养因子-3(Neurotrophin-3,NT-3)、白介素-12(interleukin-12,IL-12)、粒-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colonystimulating factor,GM-CSF)的含量。结果注射后第84天,hpDCevo组BMS评分明显高于hpDC组和其余各组(P<0.05)。组织病理学结果显示,hpDCevo组较其他组空洞和瘢痕缩小。损伤局部组织中的BDNF、NT-3、GM-CSF、IL-12含量为hpDCevo组高于hpDC组和其余各组(P<0.05);T细胞培养上清中的BDNF、GM-CSF为hpDCevo组高于hpDC组和其余各组(P<0.05)。结论hpDCevo对小鼠SCI修复有促进作用,其机制可能是通过上调损伤局部的BDNF、NT-3、GM-CSF、IL-12来实现的。

关键词：脊髓损伤树突状细胞吴茱萸碱脊髓匀浆蛋白

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负载脊髓匀浆蛋白的树突状细胞促进小鼠脊髓损伤功能恢复的作用

负载脊髓匀浆蛋白的树突状细胞促进小鼠脊髓损伤功能恢复的作用

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作者：刘明永第三军医大学

学位级别：硕士

脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)通常导致灾难性的神经功能缺损,传统治疗方法作用有限。随着对SCI免疫反应研究的深入,保护性自身免疫反应在SCI神经功能恢复中的作用引起关注。树突状细胞(dendritic cells, DCs)是专职抗原提呈细胞(a... 详细信息

脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)通常导致灾难性的神经功能缺损,传统治疗方法作用有限。随着对SCI免疫反应研究的深入,保护性自身免疫反应在SCI神经功能恢复中的作用引起关注。树突状细胞(dendritic cells, DCs)是专职抗原提呈细胞(antigen presenting cells, APC),在幼稚T细胞的活化、免疫方向的调控甚至T细胞极性的转换等方面具有重要作用。已经证实,损伤局部注射负载髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein, MBP)或其衍生肽的DCs可以促进SCI后神经功能恢复。但MBP成分单一,制备较困难,不利于临床推广且作用有限;局部注射需要显露椎管,操作复杂,损伤大。脊髓匀浆蛋白(homogenate protein of spinal cord, hp)理论上包含SCI局部所有的可能抗原成分,更为接近体内真实环境,且制备简单,便于临床使用;腹腔注射操作简单,损伤小。本文旨在探讨负载脊髓匀浆蛋白的DCs(dendritic cells pulsed with homogenate protein of spinal cord,hpDCs)能否促进SCI神经功能恢复以及腹腔注射的效果和局部注射是否有差别。材料与方法 1.制作小鼠SCI模型。成年BALB/c小鼠,使用显微外科动脉夹制作T10节段重度钳夹伤SCI模型。 2.制备小鼠未成熟DCs、hp及hpDCs。 3.实验干预及分组。实验动物分3组,伤后1天,BBB评分脊髓损伤区长度。 6.免疫组织化学染色(IHC)与免疫荧光组织化学双标法观察损伤后GFAP、Nestin、NF在损伤区表达情况,测量胶质瘢痕厚度。 7.脊髓损伤大鼠在84dpi行生物素化葡聚糖胺(biotinylated dextran amine,BDA)轴突顺行示踪,辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)轴突逆行示踪,结合IHC检测胶质瘢痕与轴突、囊腔的关系。结果 1.各组小鼠在伤后均出现完全性截瘫,1w左右BBB评分逐渐恢复。其中,hpDCs组小鼠恢复最快,于28dpi进入平台期,BBB评分高达14.0±2.0,最终达到16.3±2.1,显著高于DCs组(10.0±2.0)和hp组(10.4±1.8)(p脊髓损伤的囊腔周围GFAP+表达的星形胶质细胞肥大增生,突起丰富,构成胶质瘢痕的主要成分。与其它二组相比,hpDCs组GFAP表达出现较慢,且GFAP+细胞分布较稀疏;hpDCs组,Nestin+细胞在注射后56dpi仍可见,而其它二组在注射后28dpi基本消失;NF表达可以明确地观察到损伤后轴突分布的情况,各组无显著区别。 4.各组中,BDA顺行示踪与HRP逆行示踪观察到轴突终止于胶质瘢痕外,未到达囊腔内。结论 1.本实验制备的小鼠脊髓钳夹伤模型,造成脊髓严重不完全损伤,其病理过程和临床接近,能够模拟临床自然病程,符合实验要求。 2.局部或腹腔注射hpDCs,能够显著促进小鼠SCI神经功能恢复,而hp具有相对较弱的促进作用,单纯DCs效果最差。 3.腹腔注射和局部注射具有同样效果,表明hpDCs是通过全身性的系统免疫起作用。 ***可以延缓局部胶质瘢痕形成,降低胶质瘢痕密度和厚度,缩小局部空洞及损伤部位面积,提示可以降低胶质瘢痕对神经再生的屏障作用;可以延长局部Nestin表达,提示可以增加局部存在的内源性再生能力。 5.免疫组织化学荧光双标技术及神经纤维示踪技术证实hpDCs不能够使轴突穿过胶质瘢痕。 ***较单纯DCs或hp效果好,表明局部DCs效应不足,或者与抗原结合能力受限。综上所述,本文通过小鼠脊髓钳夹伤的神经功能评价、病理学及免疫学研究,发现负载脊髓匀浆蛋白的未成熟树突状细胞可以促进SCI后神经功能恢复,并能够改善局部组织结构。腹腔

关键词：脊髓损伤树突状细胞脊髓匀浆蛋白接种小鼠

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吴茱萸碱刺激的负载脊髓匀浆蛋白的树突状细胞修复小鼠脊髓损伤的实验研究

吴茱萸碱刺激的负载脊髓匀浆蛋白的树突状细胞修复小鼠脊髓损伤的...

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作者：王科第三军医大学

学位级别：硕士

脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)分为原发性损伤和继发性损伤,原发性损伤是由机械性损伤所导致的,继发性损伤由一系列生化、免疫机制引起,是脊髓原发性损伤之后由于各种因素引起的脊髓再损伤级联反应,加重原发性损伤,导致更严重的临... 详细信息

脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)分为原发性损伤和继发性损伤,原发性损伤是由机械性损伤所导致的,继发性损伤由一系列生化、免疫机制引起,是脊髓原发性损伤之后由于各种因素引起的脊髓再损伤级联反应,加重原发性损伤,导致更严重的临床症状。传统理论认为,抑制免疫细胞的活性能减少脊髓继发性损伤。故在SCI后的早期阶段使用甲强龙、地塞米松等减轻水肿,保护细胞膜,同时抑制免疫细胞的活性,减轻继发性损伤。然而,大量的实验证据表明:针对中枢神经系统(central nervous system, CNS)抗原的内源性自身免疫反应是有神经保护作用的。CNS抗原特异性的T细胞(比如针对髓磷脂碱性蛋白特异性T细胞)在CNS保护和修复的生理过程中起关键作用。基于先前在啮齿类动物的实验研究,Schwartz等提出了,神经变性状况下“保护性自身免疫”的概念,并将激发CNS抗原特异性T细胞免疫反应能作为一种治疗方法,减轻CNS病变,包括脊髓损伤。树突状细胞(dendritic cell, DC)是专职的抗原提呈细胞,在激发和调节适应性免疫反应中起关键作用。基于DC的免疫治疗近些年来受到大量的关注。DC已经成功的被用来产生针对肿瘤抗原特异性细胞毒T细胞,诱导免疫耐受和T细胞极化。因此,DCs作为一种疫苗能激发保护性自身免疫反应。先前,我们报道了局部或系统注射负载脊髓匀浆蛋白(homogenate protein of spinal cord,hp)的DCs(hpDC)能明显促进SCI小鼠的功能恢复。与负载髓磷脂碱性蛋白的DC相比,负载脊髓匀浆蛋白有更好的疗效。吴茱萸碱(Evodiamine, EVO),是一种从吴茱萸中提取的生物碱。它有多种生物作用,比如,抗肿瘤生长和血管生成、抗炎等作用。本课题组研究发现,在体外EVO能上调成熟DC诱导抗原特异性T细胞反应的能力。那么,吴茱萸碱刺激的负载脊髓匀浆蛋白的DC(hpDCevo)能否比负载脊髓匀浆蛋白的DC(hpDC)激发更强的针对CNS抗原特异性T淋巴细胞免疫反应,并进一步促进SCI动物的功能恢复,目前国内外尚未见报道。材料与方法: 本文首先通过腹腔注射PBS、负载脊髓匀浆蛋白的DC、吴茱萸碱刺激的负载脊髓匀浆蛋白的DC治疗T9脊髓损伤动物,采用BMS评分、组织病理学检查评估吴茱萸碱刺激的负载脊髓匀浆蛋白的DC能否促进SCI小鼠后肢功能恢复。后采用ELISA、MTT、免疫荧光实验检测小鼠脾脏T淋巴细胞的增殖活性,Th细胞分泌的细胞因子IFN-γ和IL-4探讨Th细胞极性的变化,以及神经营养因子BDNF、NT-3和神经干细胞标记物Nestin,轴突标记物NF200的表达。进一步探讨吴茱萸碱刺激的负载脊髓匀浆蛋白的DC促进SCI小鼠后肢功能恢复的可能机制。结果: 1.小鼠在建模后均出现完全性截瘫,2w左右BMS评分逐渐恢复。其中,吴茱萸碱刺激的负载脊髓匀浆蛋白的DC(hpDCevo)组小鼠恢复最快,于28dpi进入平台期,BMS评分高达6.29±0.25,最终达到6.92±0.2,显著高于负载脊髓匀浆蛋白的DC组(6.00±2.7)和PBS组(3.75±0.27)(p脊髓匀浆蛋白的DC能促进脊髓损伤小鼠后肢运动功能的恢复。 2.病理组织学检测显示,吴茱萸碱刺激的负载脊髓匀浆蛋白的DC(hpDCevo)组的损伤区面积(1.93±0.16mm2)和局部空洞范围(0.22±0.01mm2)与负载脊髓匀浆蛋白的DC(hpDC)组的损伤区面积(2.18±0.12mm2)和局部空洞范围(0.25±0.02mm2)比较均有显著统计学差异(p脊髓匀浆蛋白的DC明显减少了脊髓损伤区面积和空洞面积。 3.体外MTT实验证实,吴茱萸碱、DC、吴茱萸碱刺激的DC均不能促进同种系动物T淋巴细胞增殖;但是,负载卵清蛋白的DC(ovaDC)和吴茱萸碱刺激的负载卵清蛋白的DC(ovaDCevo)均能促进同种系动物T淋巴细胞增殖,OD值分别达到0.62±0.03、0.99±0.04,但是吴茱萸碱刺激的负载卵清蛋白的DC比负载卵清蛋白的DC激发了更加强烈的T细胞增殖(p脊髓匀浆蛋白的DC(hpDCevo)组脾脏T细胞比负载脊髓匀浆蛋白的DC(hpDC)的脾脏T细胞有更强的增殖能力(OD值分别为0.33±0.03,0.25±0.04)(p脊髓匀浆蛋白的DC组损伤局部的T细胞数量(673.33±167.17/mm2)明显高于负载脊髓匀浆蛋白的DC组(500±146.42/mm2)(p<0.0

关键词：脊髓损伤树突状细胞脊髓匀浆蛋白吴茱萸碱自身免疫反应神经保护

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