负载脊髓匀浆蛋白的树突状细胞促进小鼠脊髓损伤功能恢复的作用
作者单位：第三军医大学
学位级别：硕士
导师姓名：赵建华
授予年度：2008年
学科分类：1002[医学-临床医学] 100210[医学-外科学(含：普外、骨外、泌尿外、胸心外、神外、整形、烧伤、野战外)] 10[医学]
摘 要：脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)通常导致灾难性的神经功能缺损,传统治疗方法作用有限。随着对SCI免疫反应研究的深入,保护性自身免疫反应在SCI神经功能恢复中的作用引起关注。树突状细胞(dendritic cells, DCs)是专职抗原提呈细胞(antigen presenting cells, APC),在幼稚T细胞的活化、免疫方向的调控甚至T细胞极性的转换等方面具有重要作用。已经证实,损伤局部注射负载髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein, MBP)或其衍生肽的DCs可以促进SCI后神经功能恢复。但MBP成分单一,制备较困难,不利于临床推广且作用有限;局部注射需要显露椎管,操作复杂,损伤大。脊髓匀浆蛋白(homogenate protein of spinal cord, hp)理论上包含SCI局部所有的可能抗原成分,更为接近体内真实环境,且制备简单,便于临床使用;腹腔注射操作简单,损伤小。本文旨在探讨负载脊髓匀浆蛋白的DCs(dendritic cells pulsed with homogenate protein of spinal cord,hpDCs)能否促进SCI神经功能恢复以及腹腔注射的效果和局部注射是否有差别。 材料与方法 1.制作小鼠SCI模型。成年BALB/c小鼠,使用显微外科动脉夹制作T10节段重度钳夹伤SCI模型。 2.制备小鼠未成熟DCs、hp及hpDCs。 3.实验干预及分组。实验动物分3组,伤后1天,BBB评分2分者,分别局部或腹腔注射hp(局部:40μg/5μL;腹腔:40μg/0.3mL)、DCs(局部:1×106 cells/5μL;腹腔:1×106cells/0.3mL)或hpDCs(局部:1×106cells/5μL;腹腔:1×106cells/0.3mL)。 4.各动物每周进行BBB评分,观察神经功能恢复情况。 5.注射后28、56、84天(days post injection,dpi),左心室灌注固定后取材,HE染色观察局部病变情况,测量脊髓损伤区长度。 6.免疫组织化学染色(IHC)与免疫荧光组织化学双标法观察损伤后GFAP、Nestin、NF在损伤区表达情况,测量胶质瘢痕厚度。 7.脊髓损伤大鼠在84dpi行生物素化葡聚糖胺(biotinylated dextran amine,BDA)轴突顺行示踪,辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)轴突逆行示踪,结合IHC检测胶质瘢痕与轴突、囊腔的关系。 结果 1.各组小鼠在伤后均出现完全性截瘫,1w左右BBB评分逐渐恢复。其中,hpDCs组小鼠恢复最快,于28dpi进入平台期,BBB评分高达14.0±2.0,最终达到16.3±2.1,显著高于DCs组(10.0±2.0)和hp组(10.4±1.8)(p0.01)。腹腔注射和局部注射BBB评分结果无统计学差异。 ***染色显示各组损伤局部均出现反应性胶质瘢痕增生,空洞形成。但是,hpDCs组损伤局部空洞范围与DCs、hp组比较具有显著统计学差异(p0.01),损伤范围及胶质瘢痕厚度与DCs组具有统计学差异(p0.05)。 ***染色发现,脊髓损伤的囊腔周围GFAP+表达的星形胶质细胞肥大增生,突起丰富,构成胶质瘢痕的主要成分。与其它二组相比,hpDCs组GFAP表达出现较慢,且GFAP+细胞分布较稀疏;hpDCs组,Nestin+细胞在注射后56dpi仍可见,而其它二组在注射后28dpi基本消失;NF表达可以明确地观察到损伤后轴突分布的情况,各组无显著区别。 4.各组中,BDA顺行示踪与HRP逆行示踪观察到轴突终止于胶质瘢痕外,未到达囊腔内。 结论 1.本实验制备的小鼠脊髓钳夹伤模型,造成脊髓严重不完全损伤,其病理过程和临床接近,能够模拟临床自然病程,符合实验要求。 2.局部或腹腔注射hpDCs,能够显著促进小鼠SCI神经功能恢复,而hp具有相对较弱的促进作用,单纯DCs效果最差。 3.腹腔注射和局部注射具有同样效果,表明hpDCs是通过全身性的系统免疫起作用。 ***可以延缓局部胶质瘢痕形成,降低胶质瘢痕密度和厚度,缩小局部空洞及损伤部位面积,提示可以降低胶质瘢痕对神经再生的屏障作用;可以延长局部Nestin表达,提示可以增加局部存在的内源性再生能力。 5.免疫组织化学荧光双标技术及神经纤维示踪技术证实hpDCs不能够使轴突穿过胶质瘢痕。 ***较单纯DCs或hp效果好,表明局部DCs效应不足,或者与抗原结合能力受限。 综上所述,本文通过小鼠脊髓钳夹伤的神经功能评价、病理学及免疫学研究,发现负载脊髓匀浆蛋白的未成熟树突状细胞可以促进SCI后神经功能恢复,并能够改善局部组织结构。腹腔
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