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山羊SREBP-1基因的超表达对脂肪酸代谢相关基因表达的影响

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生物工程学报 2012年第11期28卷 1306-1316页

作者：许会芬罗军李芳余康石恒波李君林先滋朱江江西北农林科技大学动物科技学院陕西省农业分子生物学重点实验室陕西杨凌712100

本研究旨在通过构建西农萨能羊固醇调节元件结合蛋白-1(SREBP-1)基因的重组腺病毒超表达载体,获得有感染性的病毒颗粒,并检测该基因过表达后对乳腺上皮细胞中脂肪酸代谢相关基因的影响,为进一步研究该基因在脂肪酸代谢及泌乳调控中的功... 详细信息

本研究旨在通过构建西农萨能羊固醇调节元件结合蛋白-1(SREBP-1)基因的重组腺病毒超表达载体,获得有感染性的病毒颗粒,并检测该基因过表达后对乳腺上皮细胞中脂肪酸代谢相关基因的影响,为进一步研究该基因在脂肪酸代谢及泌乳调控中的功能奠定基础。根据GenBank中收录的西农萨能羊SREBP-1基因的序列设计引物,PCR扩增后进行测序。将测序正确的目的基因连接到穿梭载体pAdTrack-CMV后并进行线性化,转化含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的大肠杆菌Escherichia coli BJ5183感受态细胞中进行同源重组,将重组成功的质粒进行PacⅠ酶线性化,转染HEK 293细胞进行重组腺病毒的包装、扩繁及滴度测定。病毒液感染原代乳腺上皮细胞,实时荧光定量检测SREBP-1超表达效果及对脂肪酸代谢相关基因的影响。结果表明:重组腺病毒质粒构建成功,腺病毒滴度为109U/mL。病毒液感染乳腺上皮细胞48 h后,SREBP-1基因表达量上升大约15倍,72 h后,表达量上调了30倍;对脂肪酸代谢相关基因的影响在72 h较为明显,其中,脂肪酸合酶(FASN)及酰基辅酶A羧化酶(ACC)均显著上调了大约两倍,过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARγ)上调了大约1.5倍,肝素X受体(LXRα)及甘油三酯水解酶(ATGL)表达量升高了1.2倍;其中硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)表达水平无明显变化。表明在西农萨能羊乳腺上皮细胞中,SREBP-1能够促进脂肪酸合成相关基因的表达,对山羊乳腺脂肪酸代谢具有调控作用。

关键词：山羊 SREBP-1 超表达脂肪酸合成

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脂肪酸代谢失调影响乳腺癌发展

赣南医学院学报 2023年第6期43卷 570-576页

作者：程丽马颖超谢富华赣南医学院基础医学院生物化学与分子生物学教研室江西赣州341000

癌细胞持续增殖特性迫使其重调代谢以维持能量来源,目前认为代谢重编程是癌症标志之一。乳腺癌发病率连年增加,其代谢改变包括增强的糖酵解、三羧酸循环活性、谷氨酰胺分解和脂肪酸生物合成,在不同乳腺癌亚型中表现不同,并且与肿瘤生长... 详细信息

癌细胞持续增殖特性迫使其重调代谢以维持能量来源,目前认为代谢重编程是癌症标志之一。乳腺癌发病率连年增加,其代谢改变包括增强的糖酵解、三羧酸循环活性、谷氨酰胺分解和脂肪酸生物合成,在不同乳腺癌亚型中表现不同,并且与肿瘤生长、转移、死亡及耐药性等有着复杂关联。本文重点对目前乳腺癌脂肪酸代谢相关研究进行综述,以更好地理解脂肪酸代谢失调影响乳腺癌发展及其中相关分子机制,以期为针对代谢靶点的新型抗癌疗法提供线索。

关键词：乳腺癌代谢重编程脂肪酸合成脂肪酸氧化耐药性

三角褐指藻丙二酰单酰辅酶A:酰基载体蛋白转酰基酶的功能分析

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微生物学通报 2023年第3期50卷 1052-1061页

作者：刘萍林彬初金玲王康高永林崔玉琳烟台大学生命科学学院山东烟台264003 中国科学院烟台海岸带研究所、海岸带生物学与生物资源利用重点实验室山东烟台264003

【背景】丙二酰单酰辅酶A:酰基载体蛋白转酰基酶(malonyl coenzyme A:acyl carrier protein transacylase,MCAT)是Ⅱ型脂肪酸合酶(fatty acid synthaseⅡ,FASⅡ)的重要亚基,与脂肪酸合成直接相关,然而关于微藻MCAT的信息却很少。【目的... 详细信息

【背景】丙二酰单酰辅酶A:酰基载体蛋白转酰基酶(malonyl coenzyme A:acyl carrier protein transacylase,MCAT)是Ⅱ型脂肪酸合酶(fatty acid synthaseⅡ,FASⅡ)的重要亚基,与脂肪酸合成直接相关,然而关于微藻MCAT的信息却很少。【目的】验证三角褐指藻MCAT的功能。【方法】在模式硅藻三角褐指藻的全基因组序列中发现了一个可能的mcat基因序列,对其进行生物信息学分析,构建原核表达载体,并转入MCAT缺陷型大肠杆菌L48菌株中,最后利用GC-MS分析突变株脂肪酸的成分和含量。【结果】三角褐指藻MCAT主要结构为α-螺旋和无规则卷曲,与圆柱脆杆藻的亲缘关系最为接近,为protits型MCAT;三角褐指藻MCAT的表达使MCAT缺陷型大肠杆菌L48菌株恢复了合成脂肪酸的功能;对L48回复突变株的脂肪酸组成进行分析,发现该酶对C14:0具有底物偏好性,从而促进中长链脂肪酸如C16:0和C17:1的合成,这一特点与protits型MCAT的特性基本相符。【结论】三角褐指藻MCAT能促进脂肪酸的合成,这为微藻脂肪酸合成及代谢调控研究提供了新的线索,有利于微藻脂质的研究和应用。

关键词：三角褐指藻丙二酰单酰CoA:ACP转酰基酶脂肪酸合成功能验证

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花生种子发育过程中脂肪酸累积模式研究

中国油料作物学报 2009年第2期31卷 157-162,172页

作者：李晓丹曹应龙胡亚平肖玲武玉花吴刚卢长明中国农业科学院油料作物研究所湖北武汉430062

通过对花生种子脂肪酸累积模式的研究,揭示花生脂肪酸组成的形成规律。研究结果显示,下针后10d内的花生种子可检测到9种脂肪酸,C16∶1和C18∶3在发育过程中由高到低,逐渐消失,其他7种脂肪酸含量则随着花生种子的发育逐渐积累增高。成熟... 详细信息

通过对花生种子脂肪酸累积模式的研究,揭示花生脂肪酸组成的形成规律。研究结果显示,下针后10d内的花生种子可检测到9种脂肪酸,C16∶1和C18∶3在发育过程中由高到低,逐渐消失,其他7种脂肪酸含量则随着花生种子的发育逐渐积累增高。成熟的花生种子中油酸和亚油酸含量占脂肪酸总含量的81%左右。脂肪酸总量在接近成熟时有所下降。不同脂肪酸在累积过程中显示了高度相关性,C16∶1和C18∶3之间呈正相关,属于第一类;其余7种脂肪酸之间也均呈正相关,属于第二类。第一和第二类脂肪酸之间呈负相关。主成份分析表明,9种脂肪酸可以分成三类:C18∶1与C18∶2各为一类,其他7种脂肪酸为另一类,C18∶1与C18∶2之比是花生脂肪酸组成的决定性因素。综合分析表明,决定花生脂肪酸组成的关键基因主要是脂肪酸去饱和酶FAD2基因和SAD基因,有目的地对这两个基因的表达进行调控对于花生脂肪酸组成的改良有着重要的价值和意义。

关键词：花生种子发育脂肪酸合成相关分析

耻垢分枝杆菌MSMEG＿3150功能的初步研究

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耻垢分枝杆菌MSMEG＿3150功能的初步研究

作者：牛宏红石河子大学

学位级别：硕士

目的:将耻垢分枝杆菌作为模式菌,探讨其MSMEG＿3150基因所编码蛋白的功能,包括:MSMEG＿3150蛋白对耻垢分枝杆菌的超微结构、生长特性、表面疏水性、脂肪酸含量以及生物膜形成的影响。方法:1.生物信息学分析1.1在Gen Bank网站查询结核分... 详细信息

目的:将耻垢分枝杆菌作为模式菌,探讨其MSMEG＿3150基因所编码蛋白的功能,包括:MSMEG＿3150蛋白对耻垢分枝杆菌的超微结构、生长特性、表面疏水性、脂肪酸含量以及生物膜形成的影响。方法:1.生物信息学分析1.1在Gen Bank网站查询结核分枝杆菌的(MTB)Fab G1所编码蛋白的氨基酸序列。将其输入至Ex PASy,在线分析Fab G1的蛋白理化性质。1.2从Gen Bank获取MTB Fab G1和野生株耻垢分枝杆菌(MS-MC155)的MSMEG＿3150基因序列和氨基酸序列,再通过Blast和DNAMAN将两者分别进行基因的同源性比对和蛋白的同源性比对。2.突变菌株的构建2.1 MSMEG＿3150基因过表达菌株构建:将目的基因MSMEG＿3150与游离型载体PMV261重组并转化,构建MSMEG＿3150过表达质粒p MV261-MSMEG＿3150质粒。将阳性质粒电转化至MS-MC155中,获得MSMEG＿3150过表达菌株。2.2 MSMEG＿3150基因沉默菌株构建:利用CRSIPRi技术构建菌株。将p Tet-d Cas9质粒电转至耻垢分枝杆菌中,获得MS-d Cas9菌株,PCR验证;设计2条针对MSMEG＿3150基的单链sg RNA oligo序列;退火形成双链DNA并磷酸化,将双链DNA连接到p Grna载体中,构建p Grna-MSMEG＿3150质粒,将阳性质粒电转至MS-d Cas9感受态中,获得MSMEG＿3150沉默菌株。3.MSMEG＿3150蛋白的功能研究(1)以MS-MC155为对照组,MSMEG＿3150过表达株和沉默株为实验组,对各菌株进行抗酸染色。(2)采用光学显微镜、扫描电镜和透射电镜,观察各菌株菌体形态和细胞壁结构。(3)细菌聚集实验和刚果红实验检测细菌表面疏水性。(4)气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)测定脂肪酸成分与含量。(5)测定细菌在不同条件下的生长曲线,检测各菌株的生存能力。(6)将各菌株进行成膜性培养,结晶紫染色法定量生物膜形成。结果:1.预测了Fab G1为疏水性蛋白、稳定蛋白。MTB Fab G1和MS-MC155 MSMEG＿3150的基因序列同源性高达77.56%,而蛋白的同源性高达81.18%。2.成功构建了耻垢分枝杆菌MSMEG＿3150过表达菌株和MSMEG＿3150沉默菌株。3.MSMEG＿3150蛋白的功能研究(1)各菌株抗酸染色的结果显示,过表达株菌体较长,染色明显加深。(2)扫描电镜观察各菌株,结果显示过表达MSMEG＿3150会导致菌体变长,沉默株细菌表面褶皱增多。透射电镜观察各菌株,显示过表达株的细胞壁显著增厚,沉默株与野生株相比,细胞壁变薄。(3)细菌聚集实验结果显示,在不含Tween80的情况下,过表达株的沉淀菌较野生株和沉默株明显增多,表明过表达株的细菌更易聚集。刚果红实验发现过表达株染色最深,即表面疏水性增强。(4)绘制各菌株的生长曲线,发现在正常条件下培养60h后,过表达株的生存能力强于野生株和沉默株,但在缺氧条件下,各菌株间的差异不明显。(5)GS-MS检测结果显示,过表达株的脂质成分C16:0、C18:0、C18:1n9c、C24:0的含量高于其他菌株。(6)观察各菌株的成膜性培养,在培养72h和120h时,过表达株较其他两株均形成褶皱明显更多且致密的生物膜,相反,沉默株只能形成一层薄薄的生物膜,且膜不完整。(7)结晶紫定量生物膜显示,过表达株生物膜形成显著增多,沉默株形成的生物膜最少。结论:1.MTB Fab G1和MS-MC155 MSMEG＿3150的基因序列同源性高达77.56%,而蛋白的同源性高达81.18%。2.MS-MS155的MSMEG＿3150基因所编码蛋白与该菌的超微结构(包括菌体长度和细胞壁厚度)、生长特性、表面疏水性相关。3.MSMEG＿3150基因所编码蛋白与MS-MS155的脂肪酸合成和生物膜的形成相关。

关键词：结核分枝杆菌耻垢分枝杆菌 FabG1 生物膜脂肪酸合成

棉花3个脂肪酸碳链延长基因的cDNA克隆和表达分析

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中国农业科学 2013年第17期46卷 3523-3533页

作者：刘丽赵鹏王丹刘正杰王玉美华金平中国农业大学农学与生物技术学院/杂种优势研究与利用教育部重点实验室/作物遗传改良北京市重点实验室新疆农垦科学院棉花研究所/农业部西北内陆区棉花生物学与遗传育种重点实验室湖北省农业科学院经济作物研究所

【目的】克隆棉花脂肪酸合成碳链延长的3个重要基因,分析它们的基因表达及其对逆境胁迫的反应,为棉花高油分育种和抗逆育种提供候选基因。【方法】采用同源克隆的方法,克隆陆地棉脂肪酸合成碳链延长3个重要基因GhKAR、GhHAD和GhENR的cDN... 详细信息

【目的】克隆棉花脂肪酸合成碳链延长的3个重要基因,分析它们的基因表达及其对逆境胁迫的反应,为棉花高油分育种和抗逆育种提供候选基因。【方法】采用同源克隆的方法,克隆陆地棉脂肪酸合成碳链延长3个重要基因GhKAR、GhHAD和GhENR的cDNA全长;应用生物信息学方法,分析克隆基因编码蛋白的特性;通过RT-PCR,分析目标基因的组织表达特征、时空表达水平和非生物胁迫条件下的表达特性。【结果】GhKAR和GhENR属于NADB Rosemann超基因家族,GhHAD属于hotdog超基因家族;GhKAR、GhHAD和GhENR的cDNA全长分别为1 119、906和1 318 bp,分别编码283、221、394个氨基酸;它们在根、茎、叶及胚珠发育不同时期均有表达。3个基因在高油材料中的基因表达水平都高于低油材料;20DPA(days post anthesis)到30DPA是高低油材料油分积累的主要时期,而30DPA到成熟期是高低油材料油分含量差距产生的关键时期。20DPA低油材料3个基因均有一个表达低值,高油材料基因表达量则持续升高;30DPA时表达量达到最高,其中,对于GhHAD和GhENR的表达量,棉花高油材料为低油材料2倍以上。不同非生物胁迫的诱导表达分析表明,GhKAR、GhHAD和GhENR都不同程度地受低温诱导,GhKAR和GhHAD在ABA诱导时上调表达,但都不受MeJA诱导表达;而GhENR在MeJA诱导2 h时上调表达,之后逐渐下调,受ABA诱导不明显。【结论】获得了GhKAR、GhHAD、GhENR 3个基因cDNA全长,通过基因表达特征分析,3个基因的表达可能对种子油分积累起着重要作用,同时在棉花抗逆方面也起一定的生理作用。

关键词：陆地棉脂肪酸合成基因克隆表达量非生物胁迫

AP90和BM1调控水稻雄性不育的机理研究

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AP90和BM1调控水稻雄性不育的机理研究

作者：陈驰沈阳农业大学

学位级别：硕士

花药和花粉的发育是一种复杂的遗传现象,很容易受到阻碍,导致雄性不育。因此,需全面了解雄性不育的潜在分子和生化机制,以扩大其杂交育种的范围。本文通过甲基磺酸乙酯(Ethyl Methyl sulfone,EMS)诱变籼稻恢复系中恢8015(Zhonghui8015,w... 详细信息

花药和花粉的发育是一种复杂的遗传现象,很容易受到阻碍,导致雄性不育。因此,需全面了解雄性不育的潜在分子和生化机制,以扩大其杂交育种的范围。本文通过甲基磺酸乙酯(Ethyl Methyl sulfone,EMS)诱变籼稻恢复系中恢8015(Zhonghui8015,wild-type,WT)筛选获得了一个性状稳定的典败型雄性不育突变体材料abortive pollen 90(ap90)。突变体ap90与野生型中恢8015在株高、株型、分蘖数、抽穗期等农艺性状上无显著差异,但花药瘦小、呈淡乳黄色、花粉完全典败。花药发育不同阶段的半薄切片观察结果显示,ap90突变体内的花药壁细胞发育异常,主要表现为绒毡层细胞降解异常,小孢子细胞在有丝分裂阶段无法形成正常的花粉壁结构、无法完成淀粉充实过程,最终小孢子细胞退化成细线状、花药亦无法开裂。花药和花粉外壁扫描电镜观察结果显示,突变体ap90的花药外壁皱缩,角质层排列更紧密;花药内壁乌氏体形状不规则、排列紧密而混乱;花粉细胞呈干瘪状态,花粉外壁表面的孢粉素形态异常、呈不规则排列。遗传分析表明,ap90突变性状受一对隐性核基因控制,基因的初步定位将该突变位点定位于水稻第7号染色体长臂RM21421和RM21435之间491.73 kb区间内;进一步的Mut-Map测序分析证实该区间内LOC＿Os07g22850的第2个外显子区存在1个37 bp的缺失和1处单碱基替换,使得其编码序列发生移码、转录和翻译提前终止,导致出现ap90中的花粉完全典败和小穗不育表型。表达模式分析结果显示,该基因在花药中特异表达,Os AP90蛋白主要定位在内质网上。q PCR检测结果表明,ap90突变体中许多雄性不育相关基因的表达量受到了该突变位点的影响,进一步证明Os AP90在水稻花药发育的乌氏体形成、花粉壁发育中有重要作用。此外,利用本实验室已研究发表的无花粉型雄性不育突变体bm1、cyp703a3和cyp704b2为研究材料,进一步构建了bm1-cyp703a3和bm1-cyp704b2的双突变体并对其进行了表型考察、细胞学观察和q PCR分析,证实BM1在调控水稻花药囊壁发育和脂肪酸合成的功能上可能处于CYP703A3和CYP704B2的上游。上述研究明确了水稻无花粉型雄性不育基因BM1调控水稻雄性不育的分子机制,拓展了我们对水稻雄性生殖发育调控机制的认识,为下一步利用GAT创制智能不育系并应用于水稻杂种优势利用和杂交水稻育种生产中提供理论依据和基因资源。

关键词：水稻雄性不育 ap90 bm1 脂肪酸合成分子机理

AKR1C3促进肝癌细胞增殖、侵袭和转移的机制研究

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AKR1C3促进肝癌细胞增殖、侵袭和转移的机制研究

作者：朱鹏飞郑州大学

学位级别：硕士

背景原发性肝癌(Primary liver cancer)是世界范围内常见的消化道恶性肿瘤之一,其发病率居所有恶性肿瘤的第六位,死亡率居第四位。原发性肝癌最主要的病理类型为肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC),约占发病总数的75%-85%。HCC具... 详细信息

背景原发性肝癌(Primary liver cancer)是世界范围内常见的消化道恶性肿瘤之一,其发病率居所有恶性肿瘤的第六位,死亡率居第四位。原发性肝癌最主要的病理类型为肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC),约占发病总数的75%-85%。HCC具有发病隐匿、进展迅速等特点,多数患者确诊时已处于中晚期,失去接受外科手术机会,因此五年生存率仅为10%-18%。因此寻找HCC新的诊断与预后标志物,研究HCC快速增殖和侵袭转移的分子机制,探究HCC更为有效的治疗靶点已成为迫切需要解决的问题。AKR1C3是醛酮还原酶超家族中的一员,广泛表达于胃肠道、肝脏、前列腺及乳腺组织,参与类固醇代谢、雄激素合成等生理过程。既往研究表明AKR1C3与胃癌、前列腺癌、三阴性乳腺癌等多种恶性肿瘤相关,但其在肝癌中鲜有研究。课题组前期研究表明高表达的AKR1C3是HCC的不良预后因素,且促进HCC的发生发展,然而其分子调控机制尚未完全阐明。目的探索AKR1C3在HCC诊断与治疗中的意义,分析AKR1C3促进肝癌细胞增殖、侵袭和转移的分子机制,为临床中HCC的发生发展提供新的理论基础,为HC C的综合防治提供新的治疗靶点。资料和方法1.下载肿瘤基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库中364例HCC组织及50例癌旁组织,国际癌症基因组联盟(International Cancer Genome Consortium,ICGC)数据库中212例HCC组织和177例癌旁组织的高通量测序数据。购买包含80例HCC及癌旁组织的组织芯片,收集2020年1月份至2020年6月份在郑州大学第一附属医院确诊的25例新鲜HCC及癌旁组织,利用生物信息学分析、免疫组织化学染色、实时荧光定量PCR、Western Blot等方法检测AKR1C3在HCC组织及癌旁组织的差异表达。2.下载TCGA与ICGC数据库中HCC患者的随访信息,根据AKR1C3表达量中位数将患者分为高表达组与低表达组,进行Kaplan-Meier(K-M)生存分析。将AKR1C3表达量和患者的多项临床指标进行多因素COX回归分析,并绘制列线图(Nomogram),以确定AKR1C3是否可以作为HCC患者的独立预后因素。3.检测AKR1C3在多种肝癌细胞系中的表达量后,利用慢病毒载体分别构建肝癌细胞的AKR1C3干扰/过表达体系,进行细胞增殖实验,克隆形成实验,划痕实验及Transwell侵袭迁移实验检测AKR1C3干扰/过表达细胞的体外增殖、侵袭及转移能力的变化。4.对AKR1C3进行功能富集分析研究其可能调控的信号通路,利用Western Blot方法检测干扰/过表达AKR1C3后下游磷酸化ERK蛋白,脂肪酸合成关键酶含量变化,利用尼罗红染色证实干扰/过表达细胞中脂质含量变化。结果1.分析TCGA与ICGC的HCC及癌旁组织测序结果发现,AKR1C3在HCC组织中表达上调,差异具有统计学意义,AKR1C3可以较好的区分HCC与癌旁组织。实时荧光定量PCR、Western Blot、免疫组织化学染色等方法再次证实HCC组织中的AKR1C3在转录与翻译水平均上调。2.生存分析(K-M法)表明,TCGA与ICGC数据集中,AKR1C3高表达组的患者较低表达组有较低的生存率,差异具有统计学意义(P=0.0037,0.0063)。多因素COX回归分析显示,AKR1C3高表达是患者不良预后的独立预测因子(P=0.005,HR=1.706,95%置信区间:1.171-2.488)。利用AKR1C3 与患者临床特征构建的列线图能较准确的预测患者3年与5年生存率。3.细胞增殖实验(CCK-8法)与克隆形成实验表明,干扰AKR1C3后,肝癌细胞MHCC97-H及SMCC-7721的体外增殖能力受到显著抑制;过表达AKR1C3后,Hep G2与Li-7细胞的增殖能力显著增强。24h与48h的划痕实验证实,AKR1C3干扰体系的划痕愈合能力显著下降,而过表达AKR1C3后划痕愈合能力增强。Transwell侵袭迁移实验表明,AKR1C3干扰体系的侵袭和转移能力显著下降,过表达AKR1C3后侵袭转移能力增强。免疫缺陷鼠皮下成瘤实验证实,AKR1C3干扰组皮下肿瘤的大小、体积均显著小于对照组。4.功能富集分析提示AKR1C3可能激活HCC的ERK信号通路与脂肪酸代谢,进一步的Western Blot实验证实AKR1C3干扰体系中,磷酸化ERK、SREBP1、ACLY、ACC、FASN等蛋白含量显著降低;过表达AKR1C3后,磷酸化ERK、SREBP1、ACLY、ACC、FASN等蛋白含量增加;尼罗红染色实验证明,AKR1C3干扰体系中的脂质合成显著减少而过表达体系中则增加。结论AKR1C3在HCC组织中表达上调且具备一定的诊断与预后意义,AKR1C3可能通过激

关键词： AKR1C3 肝细胞癌增殖侵袭转移 ERK 脂肪酸合成

水稻雄性不育突变体oslddt1的表型鉴定、基因定位与功能分析

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水稻雄性不育突变体oslddt1的表型鉴定、基因定位与功能分析

作者：孙志豪中国农业科学院

学位级别：硕士

水稻花药和花粉外壁主要由绒毡层细胞分泌的脂类物质组成,对水稻花药、花粉的正常发育至关重要。尽管在水稻中,已报道了一些花粉壁形成过程中与脂质生物合成相关的调控因素,但调控脂质生物合成过程的分子机制尚不清楚。在本研究中,从本... 详细信息

水稻花药和花粉外壁主要由绒毡层细胞分泌的脂类物质组成,对水稻花药、花粉的正常发育至关重要。尽管在水稻中,已报道了一些花粉壁形成过程中与脂质生物合成相关的调控因素,但调控脂质生物合成过程的分子机制尚不清楚。在本研究中,从本团队自主构建的中恢8015 EMS突变体库中分离鉴定了雄性不育水稻突变体oslddt1(leaked and delayed degraded tapetum 1),并对其目标基因进行了功能分析,主要研究结果如下:突变体oslddt1植株表现出完全的雄性不育,花药皱缩变小、呈乳白色,花药室内无成熟花粉存在。细胞学观察结果表明,oslddt1突变体减数分裂时期的花药和花粉母细胞形态与野生型无显著差异,但其在小孢子细胞形成之后绒毡层并未发生有序降解,而是呈异常的液泡化膨大,直到有丝分裂后期才开始降解。致使小孢子在有丝分裂及其后期发育过程中乌氏体和孢粉素等营养物质的合成与供给受阻,最终导致花粉细胞完全降解,药室内呈空腔状态。证明oslddt1的无花粉表型是因其绒毡层的延迟降解和乌氏体与花粉壁形成受阻所致。利用oslddt1和粳稻02428杂交构建的F遗传群体,将目标基因定位到水稻第3染色体长臂标记JF-44和JF-46之间约28.8 kb范围内,含有7个开放阅读框。通过测序发现oslddt1-1在第四个开放阅读框(ORF,Open Reading Frame)的第9个内含子和第10个外显子区结合部位存在一个G→A的单碱基突变,导致其发生可变剪切,使得其c DNA序列插入73 bp并最终导致其转录移码和翻译提前终止;oslddt1-2在该基因的第2个内含子和第3外显子交接处也发生了一个A→G的突变和可变剪切。功能互补和基因敲除实验,进一步证实Loc＿Os03g02170为oslddt1突变体雄性不育表型的目标基因。OsLDDT1编码一种功能未知的含有DUF726的蛋白质,具有高度保守的跨膜结构域和α/β水解酶结构域。该基因在有丝分裂时期的花药中高表达,OsLDDT1蛋白质定位于内质网。在oslddt1植株中,花药发育过程中参与调控脂肪酸合成和孢粉素和花粉外壁形成的基因表现出与野生型具有存在显著差异的表达模式。进一步对野生型和突变体的花药囊壁脂肪酸测定结果发现,与WT相比,成熟oslddt1-1花药中的蜡和角质含量分别降低了74.07%和72.22%,oslddt1-1突变体花药中蜡质除了C20:0FA和C22:0FA含量分别高于野生型66.49%和80.17%,其余的长链脂肪酸、烷烃、醇类、游离脂肪酸、环氧脂肪酸和羟基脂肪酸的含量均显著降低。脂肪酸含量测定结果中蜡质含量中C16:0ω-HFA降低86.49%,C18:1ω-HFA降低86.95%,C18:2ω-HFA降低83.50%;角质含量中C16:0FA降低80.0 6%,C18:0FA降低80.74%。这些数据表明OsLDDT1可能参与脂质代谢,进而影响花药表皮形成。综上结果表明,OsLDDT1参可能与水稻花药花粉发育过程中的绒毡层发育与降解和脂质代谢等多个生物学过程,本研究相关结果为深入了解OsLDDT1在调节雄性不育中的作用提供了理论基础,相关突变体也为新一代杂交水稻育种提供了新资源。

关键词：水稻雄性不育 OsLDDT1 脂肪酸合成跨膜结构域