耻垢分枝杆菌MSMEG＿3150功能的初步研究

作     者：牛宏红 

作者单位：石河子大学 

学位级别：硕士

导师姓名：袁俐

授予年度：2022年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100103[医学-病原生物学] 10[医学] 

主      题：结核分枝杆菌 耻垢分枝杆菌 FabG1 生物膜 脂肪酸合成 

摘      要：目的:将耻垢分枝杆菌作为模式菌,探讨其MSMEG＿3150基因所编码蛋白的功能,包括:MSMEG＿3150蛋白对耻垢分枝杆菌的超微结构、生长特性、表面疏水性、脂肪酸含量以及生物膜形成的影响。方法:1.生物信息学分析1.1在Gen Bank网站查询结核分枝杆菌的(MTB)Fab G1所编码蛋白的氨基酸序列。将其输入至Ex PASy,在线分析Fab G1的蛋白理化性质。1.2从Gen Bank获取MTB Fab G1和野生株耻垢分枝杆菌(MS-MC155)的MSMEG＿3150基因序列和氨基酸序列,再通过Blast和DNAMAN将两者分别进行基因的同源性比对和蛋白的同源性比对。2.突变菌株的构建2.1 MSMEG＿3150基因过表达菌株构建:将目的基因MSMEG＿3150与游离型载体PMV261重组并转化,构建MSMEG＿3150过表达质粒p MV261-MSMEG＿3150质粒。将阳性质粒电转化至MS-MC155中,获得MSMEG＿3150过表达菌株。2.2 MSMEG＿3150基因沉默菌株构建:利用CRSIPRi技术构建菌株。将p Tet-d Cas9质粒电转至耻垢分枝杆菌中,获得MS-d Cas9菌株,PCR验证;设计2条针对MSMEG＿3150基的单链sg RNA oligo序列;退火形成双链DNA并磷酸化,将双链DNA连接到p Grna载体中,构建p Grna-MSMEG＿3150质粒,将阳性质粒电转至MS-d Cas9感受态中,获得MSMEG＿3150沉默菌株。3.MSMEG＿3150蛋白的功能研究(1)以MS-MC155为对照组,MSMEG＿3150过表达株和沉默株为实验组,对各菌株进行抗酸染色。(2)采用光学显微镜、扫描电镜和透射电镜,观察各菌株菌体形态和细胞壁结构。(3)细菌聚集实验和刚果红实验检测细菌表面疏水性。(4)气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)测定脂肪酸成分与含量。(5)测定细菌在不同条件下的生长曲线,检测各菌株的生存能力。(6)将各菌株进行成膜性培养,结晶紫染色法定量生物膜形成。结果:1.预测了Fab G1为疏水性蛋白、稳定蛋白。MTB Fab G1和MS-MC155 MSMEG＿3150的基因序列同源性高达77.56%,而蛋白的同源性高达81.18%。2.成功构建了耻垢分枝杆菌MSMEG＿3150过表达菌株和MSMEG＿3150沉默菌株。3.MSMEG＿3150蛋白的功能研究(1)各菌株抗酸染色的结果显示,过表达株菌体较长,染色明显加深。(2)扫描电镜观察各菌株,结果显示过表达MSMEG＿3150会导致菌体变长,沉默株细菌表面褶皱增多。透射电镜观察各菌株,显示过表达株的细胞壁显著增厚,沉默株与野生株相比,细胞壁变薄。(3)细菌聚集实验结果显示,在不含Tween80的情况下,过表达株的沉淀菌较野生株和沉默株明显增多,表明过表达株的细菌更易聚集。刚果红实验发现过表达株染色最深,即表面疏水性增强。(4)绘制各菌株的生长曲线,发现在正常条件下培养60h后,过表达株的生存能力强于野生株和沉默株,但在缺氧条件下,各菌株间的差异不明显。(5)GS-MS检测结果显示,过表达株的脂质成分C16:0、C18:0、C18:1n9c、C24:0的含量高于其他菌株。(6)观察各菌株的成膜性培养,在培养72h和120h时,过表达株较其他两株均形成褶皱明显更多且致密的生物膜,相反,沉默株只能形成一层薄薄的生物膜,且膜不完整。(7)结晶紫定量生物膜显示,过表达株生物膜形成显著增多,沉默株形成的生物膜最少。结论:1.MTB Fab G1和MS-MC155 MSMEG＿3150的基因序列同源性高达77.56%,而蛋白的同源性高达81.18%。2.MS-MS155的MSMEG＿3150基因所编码蛋白与该菌的超微结构(包括菌体长度和细胞壁厚度)、生长特性、表面疏水性相关。3.MSMEG＿3150基因所编码蛋白与MS-MS155的脂肪酸合成和生物膜的形成相关。