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大肠杆菌胸苷激酶基因的克隆表达与应用研究

生物技术 2013年第5期23卷 20-24页

作者：张广宇丁庆豹欧伶华东理工大学生物工程学院上海200237

目的:构建含大肠杆菌胸苷激酶基因(tdk)的重组质粒,并对胸苷激酶性质进行研究。方法:通过PCR技术从大肠杆菌K-12中扩增出tdk基因,并克隆到表达载体pET-28a(+)上,转入大肠杆菌BL21(DE3)中构建重组菌株(DTK)。结果:成功扩增出了tdk基因,... 详细信息

目的:构建含大肠杆菌胸苷激酶基因(tdk)的重组质粒,并对胸苷激酶性质进行研究。方法:通过PCR技术从大肠杆菌K-12中扩增出tdk基因,并克隆到表达载体pET-28a(+)上,转入大肠杆菌BL21(DE3)中构建重组菌株(DTK)。结果:成功扩增出了tdk基因,并构建了重组菌株。结论:获得的tdk基因长为618bp,重组菌株能表达出大量可溶性胸苷激酶蛋白。胸苷激酶的酶比活力可达到1 600U/mg;酶最适温度为45℃;最适pH为8.0。同时,胸苷激酶最佳反应条件为:50mmol/L pH 8.0的Tris-HCl缓冲液,30U的粗酶,5mmol/L的MgCl2,5mmol/L的TR,5mol/L的ATP,45℃反应100min,胸苷酸的转化率可达到60%以上。

关键词：胸苷胸苷酸胸苷激酶

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云南地区胃癌患者TS和MTHFR基因多态性与mRNA及蛋白表达的相关性分析

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云南地区胃癌患者TS和MTHFR基因多态性与mRNA及蛋白表达的相关性...

作者：潘欣昆明医科大学

学位级别：硕士

目的：对5-FU相关代谢酶TS和MTHFR进行基因多态性检测,探讨这些基因多态性与TS和MTHFR在云南胃癌患者中mRNA、蛋白表达的相关性,并将云南胃癌患者和健康人群的TS基因多态性分布频率进行比较,为阐明氟尿嘧啶类药物疗效个体差异的分子机... 详细信息

目的：对5-FU相关代谢酶TS和MTHFR进行基因多态性检测,探讨这些基因多态性与TS和MTHFR在云南胃癌患者中mRNA、蛋白表达的相关性,并将云南胃癌患者和健康人群的TS基因多态性分布频率进行比较,为阐明氟尿嘧啶类药物疗效个体差异的分子机制和胃癌个体化化疗提供理论依据。方法：1.收集经病理组织学检查确诊,且并未接受术前辅助化疗的31例云南籍胃癌患者癌组织,采用PCR-RFLP方法检测胃癌患者TS基因3'UTR+/-6bp、5'UTR2R/3R及3R G>C基因型,用Taqman探针方法对MTHFR677C>T和1298A>C基因型进行检测,用实时荧光定量PCR及蛋白免疫印迹分别检测胃癌患者的TS和MTHFR的mRNA和蛋白表达。采用单因素ANOVA检验TS和MTHFR基因多态性与mRNA、蛋白表达量的相关性。2.采集入选的31例胃癌患者外周血2m1,比较胃癌患者组织和血液DNA基因型差异性,在此基础上,收集云南籍健康志愿者200人,采取其外周血2ml,并采用PCR-RFLP方法检测胃癌患者和健康人群TS基因3'UTR+/-6bp(?)5'UTR2R/3R基因型,采用四格表卡方检验比较云南地区胃癌患者和健康人群的等位基因频率差异。结果：1.在本研究中,发现TS基因3'UTR基因多态性+/-6bp基因型患者较-/-6bp基因型患者的mRNA和蛋白表达量明显升高(mRNA:P=0.043;protein:P=0.011)。5'UTR2R/3R基因多态性3R/3R基因型患者较2R/2R基因型患者的蛋白表达量显著升高(P=0.003),2R/3R基因型患者较2R/2R基因型患者的蛋白表达量明显升高(P=0.016)。其余多态性位点的基因型与其mRNA和蛋白表达量间未发现相关性(P>0.05)。2.本研究中31例胃癌患者的组织DNA和外周血DNA基因分型一致。TS基因3'UTR+6bp和-6bp等位基因在云南健康人群中的频率为33.5%和66.5%,在胃癌患者中的频率为25.8%和74.2%;5'UTR2R和3R等位基因在云南健康人群中频率为15%和85%,在胃癌患者中的频率为22.6%和77.4%。云南地区健康人群和胃癌患者的TS基因3'UTR+/-6bp和5'UTR2R/3R等位基因分布频率未发现统计学差异(P>0.05)。结论：本研究发现TS基因3'UTR+/-6bp和5'UTR2R/3R多态性与TS蛋白表达存在相关性,TS基因多态性可能通过改变表达水平从而影响TS的酶活性。其余多态性未发现与mRNA和蛋白表达的相关性,具体的分子机制还有待进一步究。在本研究中,云南胃癌患者和健康人群的TS基因3'UTR+/-6bp和5'UTR2R/3R等位基因分布频率未显示出差异,因此推断,基于更大样本量得出的云南健康人群基因分布频率在一定程度上更能反映本地胃癌患者的基因分布频率。

关键词：胃癌胸苷酸合成酶亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性表达量

大肠杆菌胸苷激酶和聚磷酸激酶的重组表达与应用研究

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大肠杆菌胸苷激酶和聚磷酸激酶的重组表达与应用研究

作者：张广宇华东理工大学

学位级别：硕士

胸苷激酶(TK)是大肠杆菌胸苷酸补救代谢途径中的关键酶之一,该酶在Mg2+存在下,可以腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)作为磷酸基团的供体,催化胸苷(TR)磷酸化,生成胸苷酸(TMP)。聚磷酸激酶(PPK)可以多聚磷酸为底物,并将磷酸基团转移至ADP生成ATP。... 详细信息

胸苷激酶(TK)是大肠杆菌胸苷酸补救代谢途径中的关键酶之一,该酶在Mg2+存在下,可以腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)作为磷酸基团的供体,催化胸苷(TR)磷酸化,生成胸苷酸(TMP)。聚磷酸激酶(PPK)可以多聚磷酸为底物,并将磷酸基团转移至ADP生成ATP。利用聚磷酸激酶的这种特性,将其与大肠杆菌中的胸苷激酶催化的反应偶联,可有效地形成ATP循环,将多聚磷酸中的磷酸基团以ATP为中介,转移至胸苷,生成胸苷酸。本研究主要是构建含胸苷激酶和聚磷酸激酶基因的重组菌株,以此将两个反应联系起来,形成一个以ATP为中介的能量循环体系,实现胸苷酸的不断生成。将大肠杆菌K-12的胸苷激酶基因tdk和聚磷酸激酶基因ppk,分别克隆到pET-28a表达载体上,并转入大肠杆菌BL21(DE3)中,构建了重组菌株DTK和DPK,同时构建了串联共表达重组菌株DKK。经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析可得,各重组菌株均可表达出可溶性酶蛋白,并对各蛋白的酶活性进行分析,发现重组菌表达出的酶活力远远高于大肠杆菌宿主菌。对重组菌株转化核苷的能力也做了研究,结果表明：在pH8.0的Tris-HCl缓冲液中,45℃条件下,重组菌DTK可以催化TR生成TMP,转化率可达到60%以上;在pH8.0的Tris-HCl缓冲液中,55℃条件下,重组菌DPK可以催化ADP生成ATP,转化率可达到20%左右;重组菌DKK可以多聚磷酸钠和ADP为底物,催化TR生成TMP,其转化率为13%左右。

关键词：胸苷激酶聚磷酸激酶胸苷酸腺嘌呤核苷三磷酸

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矮牵牛PhDHFR功能初步鉴定

矮牵牛PhDHFR功能初步鉴定

作者：王荣敏华南农业大学

学位级别：硕士

在动植物及其它生物体内,时刻发生着各种代谢,叶酸是植物新陈代谢的核心。叶酸在所有生命体中都发挥着非常重要的作用,它参与重要生物分子的合成,例如氨基酸,核酸,蛋白质等。植物可以从头合成叶酸,而人类缺乏叶酸合成的完整途径。人体... 详细信息

在动植物及其它生物体内,时刻发生着各种代谢,叶酸是植物新陈代谢的核心。叶酸在所有生命体中都发挥着非常重要的作用,它参与重要生物分子的合成,例如氨基酸,核酸,蛋白质等。植物可以从头合成叶酸,而人类缺乏叶酸合成的完整途径。人体需要饮食叶酸,植物性食物是人类最重要的叶酸来源。叶酸的生物合成控制对植物的生长具有重要意义。二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase,DHFR)是叶酸合成途径的关键酶,它将二氢叶酸还原成四氢叶酸,从而参与一碳单位的转移反应和一系列的生物合成反应。胸苷酸合酶(thymidylate synthase,TS)是DNA生物合成的关键酶,它催化尿嘧啶脱氧核苷(dUMP)甲基化生成胸腺嘧啶脱氧核苷(dTMP),为DNA的合成提供前体,在DNA合成中发挥重要作用。在高等植物中,DHFR/TS是一种双功能酶。本研究中,利用VIGS技术,对矮牵牛(Petunia hybrida)PhDHFR的功能进行初步鉴定,主要结果如下:(1)PhDHFR在矮牵牛叶的不同发育阶段的表达量不同,在幼叶中表达量最高,老叶最低。(2)和对照植株相比,PhDHFR沉默植株的表型发生明显变化,植株变矮、株型紧凑且开花晚;叶片和花萼出现不同程度的畸形;茎变短,且表皮细胞变短变宽,排列不规则;叶片中的叶酸含量降低;叶绿素含量在幼叶期和成熟叶期都比对照低,尤其是幼叶基部,老叶中的叶绿素含量高于对照;植株不同发育阶段叶片中DNA甲基化水平均降低。

关键词：叶酸胸苷酸 PhDHFR PhTS DNA甲基化

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国外动态

中国肿瘤 2002年第2期 58-59页

Predictive value of thymidylate synthase expression in advanced colorectal cancer patients receiving fluoropyrimidine-based chemotherapy. Evidence from 24 studies

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南京医科大学学报（自然科学版） 2008年第12期28卷 1632-1632页

作者： Qiu, Li-Xin Tang, Qi-Yun Bai, Jian-Ling Qian , Xiao-Ping Li, Ru-Tian Liu, Bao-Rui Zheng, Ming-Hua Nanjing Med Univ Nanjing Drum Tower Hosp Ctr CancNanjing 210008 Peoples R China Nanjing Med Univ Affiliated Hosp 1 Dept GastroenterolNanjing 210008 Peoples R China Nanjing Med Univ Sch Publ Hlth Dept Epidemiol & Biostat Nanjing 210008 Peoples R China Nanjing Med Univ Affiliated Drum Tower Hosp Ctr Canc Sch Med Nanjing 210008 Peoples R China First Affiliated Hosp Wenzhou Med Coil Dept Infect & Liver Dis Wenzhou Peoples R China

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赛维健有奖征文

临床肿瘤学杂志 2013年第6期 476-476页

赛维健(注射用雷替曲塞)属叶酸结构类似物抗叶酸制剂,通过一系列途径进入细胞内作用于胸苷酸合成酶(TS),在细胞内代谢产生的多聚谷氨酸类化合物是比雷替曲塞更强的TS酶抑制剂,直接特异性的作用于叶酸结合部位,该化合物半衰期长达198小时... 详细信息

赛维健(注射用雷替曲塞)属叶酸结构类似物抗叶酸制剂,通过一系列途径进入细胞内作用于胸苷酸合成酶(TS),在细胞内代谢产生的多聚谷氨酸类化合物是比雷替曲塞更强的TS酶抑制剂,直接特异性的作用于叶酸结合部位,该化合物半衰期长达198小时,在细胞内长时间发挥抗肿瘤作用。雷替曲塞为非氟尿嘧啶类药物,与5-FU虽同属于TS酶抑制剂,但作用机制不同,不会导致相关

关键词：雷替曲塞 TS 兰替特噻叶酸制剂多聚谷氨酸胸苷酸

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药物抗性和新治疗药开发

中国新药杂志 2000年第9期 662-662页