大肠杆菌胸苷激酶和聚磷酸激酶的重组表达与应用研究

作     者：张广宇 

作者单位：华东理工大学 

学位级别：硕士

导师姓名：欧伶

授予年度：2013年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：胸苷激酶 聚磷酸激酶 胸苷酸 腺嘌呤核苷三磷酸 

摘      要：胸苷激酶(TK)是大肠杆菌胸苷酸补救代谢途径中的关键酶之一,该酶在Mg2+存在下,可以腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)作为磷酸基团的供体,催化胸苷(TR)磷酸化,生成胸苷酸(TMP)。聚磷酸激酶(PPK)可以多聚磷酸为底物,并将磷酸基团转移至ADP生成ATP。利用聚磷酸激酶的这种特性,将其与大肠杆菌中的胸苷激酶催化的反应偶联,可有效地形成ATP循环,将多聚磷酸中的磷酸基团以ATP为中介,转移至胸苷,生成胸苷酸。本研究主要是构建含胸苷激酶和聚磷酸激酶基因的重组菌株,以此将两个反应联系起来,形成一个以ATP为中介的能量循环体系,实现胸苷酸的不断生成。 将大肠杆菌K-12的胸苷激酶基因tdk和聚磷酸激酶基因ppk,分别克隆到pET-28a表达载体上,并转入大肠杆菌BL21(DE3)中,构建了重组菌株DTK和DPK,同时构建了串联共表达重组菌株DKK。经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析可得,各重组菌株均可表达出可溶性酶蛋白,并对各蛋白的酶活性进行分析,发现重组菌表达出的酶活力远远高于大肠杆菌宿主菌。 对重组菌株转化核苷的能力也做了研究,结果表明：在pH8.0的Tris-HCl缓冲液中,45℃条件下,重组菌DTK可以催化TR生成TMP,转化率可达到60%以上;在pH8.0的Tris-HCl缓冲液中,55℃条件下,重组菌DPK可以催化ADP生成ATP,转化率可达到20%左右;重组菌DKK可以多聚磷酸钠和ADP为底物,催化TR生成TMP,其转化率为13%左右。