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枣疯病植原体胸苷激酶基因的克隆、序列分析与原核表达

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浙江农业学报 2023年第8期35卷 1763-1772页

作者：宋传生康晓飞樊庆忠王俊刚石雪张子汝谭青青曾小娇刘芳李英赛侯常跃菏泽学院农业与生物工程学院山东菏泽274015

枣疯病(jujube witches-broom,JWB)俗称枣树的“癌症”,是由枣疯病植原体导致的侵染性病害,给我国的枣栽培与生产造成了严重危害,对枣疯病植原体增殖基因的研究有助于枣疯病的有效防治。为获得枣疯病植原体胸苷激酶基因(tdk),利用PCR方... 详细信息

枣疯病(jujube witches-broom,JWB)俗称枣树的“癌症”,是由枣疯病植原体导致的侵染性病害,给我国的枣栽培与生产造成了严重危害,对枣疯病植原体增殖基因的研究有助于枣疯病的有效防治。为获得枣疯病植原体胸苷激酶基因(tdk),利用PCR方法扩增该基因并测序,结果表明,该基因的开放阅读框长度为576 bp,编码191个氨基酸,其蛋白质分子量为21.76 ku。序列分析和预测表明,该蛋白质为植原体细胞质中性质相对稳定的亲水蛋白质。遗传距离和进化树分析显示,植原体tdk基因比其16S rDNA基因的保守程度低,tdk基因和16S rDNA基因序列的进化树高度相似,表明tdk基因适于植原体分子分类。为获得枣疯病植原体TDK蛋白,成功构建了原核表达载体pET-28a-JWB-Heze-tdk;在诱导条件为0.1 mmol·L^(-1)IPTG、20℃、140 r·min^(-1)时,该原核表达载体在Escherichia coli BL21(DE3)菌株中可表达出大量可溶性的N端融合了6×His标签的JWB-Heze TDK蛋白;利用Ni-IDA琼脂糖树脂纯化出了可溶性的JWB-Heze TDK融合蛋白。研究结果为JWB-Heze TDK体外酶活性测定和抗体制备奠定了基础。

关键词：枣疯病植原体胸苷激酶基因克隆原核表达蛋白质纯化

MDV与其他α疱疹病毒编码的胸苷激酶结构比较分析及体外活性验证

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MDV与其他α疱疹病毒编码的胸苷激酶结构比较分析及体外活性验证

作者：王芮河南农业大学

学位级别：硕士

马立克氏病(Marek’s Disease,MD)是由马立克氏病病毒(Marek’s Disease Virus,MDV)感染鸡引起的以严重的免疫抑制、神经症状和快速发病性淋巴瘤为主要特征疾病。MD可作为一种天然肿瘤的生物医学模型。MDV属于疱疹病毒科,α疱疹病毒亚... 详细信息

马立克氏病(Marek’s Disease,MD)是由马立克氏病病毒(Marek’s Disease Virus,MDV)感染鸡引起的以严重的免疫抑制、神经症状和快速发病性淋巴瘤为主要特征疾病。MD可作为一种天然肿瘤的生物医学模型。MDV属于疱疹病毒科,α疱疹病毒亚科中的一员,基因组结构与α疱疹病毒亚型单纯疱疹病毒(HSV)相似。在α疱疹病毒中,UL23基因编码的胸苷激酶(Thymidine kinase,TK)是与病毒毒力相关的体外复制非必需蛋白,常作为抗疱疹病毒感染的治疗药物靶点以及抗肿瘤治疗中的自杀基因,也是基因工程疫苗研发的重要位点。作为HSV/TK的同系物,MDV UL23编码TK的功能仍然未知。本课题为了探究MDV/TK的结构和功能,开展如下研究内容:1.MDV/TK蛋白结构预测分析利用Meg Align和Pymol软件,进行MDV-1/TK、MDV-2/TK、HVT/TK、HSV-1/TK和PRV/TK氨基酸序列和三级结构比对,并利用Autodock软件将TK蛋白三级结构与核苷分子及其类似物进行对接分析,再利用POCASA在线软件对5种TK蛋白质表面或内部具有结合配体的合适性质的空腔(活性口袋)进行预测。结果表明这5种TK氨基酸序列同源性较低,但空间构象十分相似,尤其是功能相关氨基酸位点高度保守;通过对5种TK与底物分子胸腺嘧啶核苷(TR)和阿昔洛韦(ACV)对接,潜在的作用位点也高度保守;通过与HSV/TK的活性口袋进行比较分析,发现MDV/TK存在潜在的活性口袋,底物分子TR可包裹在预测的活性口袋中。由此,我们推测MDV/TK可能发挥与HSV/TK和PRV/TK相似的生物学功能。2.MDV-1/TK、MDV-2/TK、HVT/TK、HSV-1/TK和PRV/TK蛋白表达及纯化为了验证5种TK是否都发挥酶活性,首先通过构建原核表达质粒,在大肠杆菌种诱导表达MDV-1/TK、MDV-2/TK、HVT/TK、HSV-1/TK和PRV/TK蛋白。经过优化诱导表达温度及IPTG浓度,SDS-PAGE结果显示MDV-1/TK、MDV-2/TK、HVT/TK、HSV-1/TK和PRV/TK蛋白均能够在裂解细菌上清中可溶性表达。经GST-tag纯化柱和分子筛纯化,Western blot结果表明成功获得5种高纯度TK蛋白,为验证其体外酶活性打下材料基础。3.MDV-1/TK、MDV-2/TK、HVT/TK、HSV-1/TK和PRV/TK体外酶活性验证为进一步验证5种TK的酶活性,首先确定了TK催化反应条件,再以ATP和TR为底物,分别向体系加入MDV-1/TK、MDV-2/TK、HVT/TK、HSV-1/TK和PRV/TK蛋白,37℃反应1 h,利用高效液相色谱(HPLC)检测催化反应产物。结果发现5种蛋白催化反应体系均生成ADP和d TMP。再利用ACV为底物,模拟与TR底物分子相同的反应条件,HPLC检测催化反应产物均为ADP和ACV-MP。这些结果表明MDV-1/TK、MDV-2/TK和HVT/TK均发挥胸苷激酶的活性,能够催化核苷及其类似物发生磷酸化,与HSV-1/TK和PRV/TK酶活性功能一致。综上所述,本研究通过MDV与其他α疱疹病毒编码的TK结构和功能比较分析,揭示了MDV/TK与HSV-1/TK、PRV/TK三级结构及酶功能区结构相似性,证明其作为胸苷激酶的体外催化活性。为进一步探究其参与病毒致病机制和疫苗研发提供了新的思路,也为构建以α疱疹病毒编码的TK为研究靶点的病毒和肿瘤模型打下良好的基础。

关键词：马立克氏病马立克氏病病毒 α疱疹病毒 UL23 胸苷激酶

人端粒酶逆转录酶启动子调控下胞嘧啶脱氨酶胸苷激酶融合基因治疗卵巢癌的体外研究

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中华妇产科杂志 2004年第6期39卷 390-395页

作者：孔北华宋悦马道新曲迅江森山东大学齐鲁医院妇产科济南250012 山东大学齐鲁医院中心血液病研究室济南250012

目的　探讨人端粒酶逆转录酶 (hTERT)启动子调控下的融合双自杀基因———胞嘧啶脱氨酶胸苷激酶 / 5 氟胞嘧啶 +更昔洛韦 (CD TK/ 5 FC +GCV)系统对人卵巢癌细胞及正常细胞的体外杀伤作用。方法　应用脂质体转染法将hTERT核心启动子... 详细信息

目的　探讨人端粒酶逆转录酶 (hTERT)启动子调控下的融合双自杀基因———胞嘧啶脱氨酶胸苷激酶 / 5 氟胞嘧啶 +更昔洛韦 (CD TK/ 5 FC +GCV)系统对人卵巢癌细胞及正常细胞的体外杀伤作用。方法　应用脂质体转染法将hTERT核心启动子报告质粒pBTdel 2 79转染人卵巢癌细胞系3AO、正常卵巢上皮细胞 (NOEC)和人胚肺成纤维细胞株HELF ,用荧光素酶分析检测hTERT启动子活性 ;应用RT PCR技术检测hTERTmRNA的表达水平。应用基因克隆技术分别构建hTERT启动子和巨细胞病毒 (CMV)启动子调控下的CD TK基因真核表达载体pBTdel 2 79 CD TK和pcDNA3 CD TK ,以及hTERT启动子调控下的TK基因表达载体pBTdel 2 79 TK。用四甲基偶氮唑蓝 (MTT)法和流式细胞术检测pBTdel 2 79 CD TK/ 5 FC +GCV系统和pcDNA3 CD TK/ 5 FC +GCV系统对上述 3种细胞不同的杀伤作用 ;应用RT PCR技术检测pBTdel 2 79 CD TK和pcDNA3 CD TK转染前后 3AO和NOEC细胞中CD和TK基因的表达情况。用扫描电子显微镜观察pBTdel 2 79 CD TK/ 5 FC +GCV作用后 3AO细胞的形态变化。结果　卵巢癌细胞系 3AO中hTERT启动子活性增高 ,为 2 4 1% ,RT PCR检测hTERTmRNA为阳性 ,而在正常细胞NOEC和HELF中 ,hTERT启动子活性仅为 0 3%和 0 7% ,hTERTmRNA为阴性。

关键词：人端粒酶逆转录酶启动子调控胞嘧啶脱氨酶胸苷激酶基因治疗卵巢癌体外研究

慢病毒介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因／丙氧鸟苷体系抑制人晶状体上皮细胞的研究

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中华眼科杂志 2007年第9期43卷 810-816页

作者：杨晋卢奕郭礼和刘天津莫晓芬复旦大学附属眼耳鼻喉科医院眼科 200031 中国科学院上海细胞生物学研究所

目的探讨慢病毒介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因／丙氧鸟苷体系（HSV—tk／GCV）对人晶状体上皮细胞（LECs）系的杀伤效应的机制。方法HSV—tk基因和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因共表达的慢病毒感染细胞为试验组，仅表达EGFP的... 详细信息

目的探讨慢病毒介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因／丙氧鸟苷体系（HSV—tk／GCV）对人晶状体上皮细胞（LECs）系的杀伤效应的机制。方法HSV—tk基因和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因共表达的慢病毒感染细胞为试验组，仅表达EGFP的慢病毒感染细胞和正常细胞为对照组。流式细胞仪检测病毒的转染效率，荧光显微镜观察及基因组PCR和RT-PCR检测基因在LECs内表达，DNA ladder和电镜观察该系统对LECs的杀伤作用，检测HSV—tk／GCV系统的浓度时间依赖性和旁观者效应。结果HSV—tk整合入LECs并高效表达。10～25μg／ml的GCV能明显诱导转染HSV—tk的细胞凋亡或坏死，且随GCV浓度升高和作用时间延长效应增强，且存在明显的旁观者效应，而对照组细胞无显著改变。当GCV浓度〉25μg／ml，对照组细胞的增殖也被显著抑制。结论GCV可高效杀伤表达HSV-tk的LECs，且旁观者效应显著增强了HSV—tk／GCV系统的杀伤效果。HSV—tk和EGFP共表达的慢病毒载体能高效稳定转染LECs。

关键词：基因,转基因,自杀慢病毒属发光蛋白质类单纯疱疹病毒属胸苷激酶晶体上皮细胞

腺病毒载体介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/丙氧鸟苷体系对晶状体上皮细胞的作用

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中华眼科杂志 2002年第10期38卷 618-622,I002页

作者：王冰翁景宁福建医科大学附属协和医院眼科福州350001

目的　观察腺病毒载体介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶 (herpessimplexvirusthymidinekinase ,HSV tk)基因 /丙氧鸟苷 (ganciclovir,GCV)体系对体外培养的牛晶状体上皮细胞的杀伤效应 ,并初步探讨晶状体上皮细胞死亡的机制。方法　利用携带H... 详细信息

目的　观察腺病毒载体介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶 (herpessimplexvirusthymidinekinase ,HSV tk)基因 /丙氧鸟苷 (ganciclovir,GCV)体系对体外培养的牛晶状体上皮细胞的杀伤效应 ,并初步探讨晶状体上皮细胞死亡的机制。方法　利用携带HSV tk基因的重组腺病毒载体adenoviralvector(ADV) /HSV tk ,感染体外培养的牛晶状体上皮细胞后用GCV治疗 ,并观察疗效。以切除E1区的空腺病毒载体ADV/Empty作为对照。以电镜、TUNEL法及吖啶橙溴化乙啶染色法检测晶状体上皮细胞的凋亡及坏死情况。结果　GCV在体外对感染ADV/HSV tk的牛晶状体上皮细胞有明显的杀伤作用 ,且具有旁观者效应 ,而对转染了ADV/Empty的细胞则无显著的毒性。GCV的杀伤效应随剂量的增大及时间延长而增强。导入HSV tk基因的晶状体上皮细胞出现明显的细胞凋亡现象 ,而且细胞的凋亡率 (t=7 2 8,P <0 0 1)及坏死率 (t=14 72 ,P <0 0 0 1)显著高于对照组。结论　腺病毒载体可将HSV tk基因转导入牛晶状体上皮细胞中 ;GCV可有效杀伤表达HSV tk的晶状体上皮细胞 ;HSV tk/GCV体系引发的细胞死亡可能与凋亡及坏死两种机制有关 ;腺病毒载体介导的HSV tk/GCV体系有可能成为后发性白内障的有效治疗方法。

关键词：单纯疱疹病毒晶状体上皮细胞腺病毒科胸苷激酶丙氧鸟苷晶状体后囊膜混浊白内障

缺氧对血管内皮生长因子启动子-胸苷激酶系统杀伤肝癌细胞系的增强作用

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中华肿瘤杂志 2002年第5期24卷 455-457页

作者：王孟龙殷正丰吴宗娣王率钱海华康晓燕吴孟超第二军医大学东方肝胆外科医院分子肿瘤实验室上海200438

目的　探讨缺氧对腺病毒介导的血管内皮生长因子启动子胸苷激酶系统 (AdVEGF tk)对肝癌细胞系HepG2选择性杀伤活性的增强作用。方法　采用AdEasysystem构建重组腺病毒载体AdVEGF tk和AdVEGF GFP ,在 2 93细胞中包装、扩增后 ,分别感染... 详细信息

目的　探讨缺氧对腺病毒介导的血管内皮生长因子启动子胸苷激酶系统 (AdVEGF tk)对肝癌细胞系HepG2选择性杀伤活性的增强作用。方法　采用AdEasysystem构建重组腺病毒载体AdVEGF tk和AdVEGF GFP ,在 2 93细胞中包装、扩增后 ,分别感染LO2 (正常肝细胞系 )和HepG2。AdVEGF GFP感染细胞经正常培养 2 4h后 ,在荧光显微镜下观察其荧光蛋白表达情况 ;AdVEGF tk感染细胞在缺氧或不缺氧条件下培养 ,并给予不同浓度的丙氧鸟苷 (GCV)处理 ,用MTT法检测感染细胞的增殖情况。结果　AdVEGF GFP感染的L0 2细胞仅见稀散的荧光 ,而AdVEGF GFP感染的HepG2细胞则出现大量荧光。感染AdVEGF tk后 ,当感染指数 (MOI)为 10 0且GCV浓度为 10 μg/ml时 ,L0 2细胞在不缺氧条件下对GCV几乎不敏感 ,但在缺氧条件下 ,70 %以上的细胞被杀死 ;而HepG2细胞即便在不缺氧培养条件下也有 6 0 %以上的细胞被杀死 ,缺氧则使 80 %以上细胞被杀死。结论　缺氧可加强腺病毒介导的AdVEGF

关键词：肝癌缺氧血管内皮生长因子胸苷激酶腺病毒载体血管生成

人胰岛素样生长因子ⅡP4启动子调控胸苷激酶载体的构建

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中华肝脏病杂志 2011年第6期19卷 460-463页

作者：周鸿科杨冬华汤绍辉黄卫暨南大学附属第一医院消化科广州510630

目的探讨人胰岛素样生长因子Ⅱ（IGF-Ⅱ）P4启动子调控单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-tk）／丙氧鸟苷（GCV）自杀基因系统体外对人肝癌细胞的选择性杀伤效应。方法用分子生物学方法构建IGF-ⅡP4启动子和巨细胞病毒启动子（CMV）调控下HSVt... 详细信息

目的探讨人胰岛素样生长因子Ⅱ（IGF-Ⅱ）P4启动子调控单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-tk）／丙氧鸟苷（GCV）自杀基因系统体外对人肝癌细胞的选择性杀伤效应。方法用分子生物学方法构建IGF-ⅡP4启动子和巨细胞病毒启动子（CMV）调控下HSVtk与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）融合基因穿梭质粒，并用脂质体转染法将其转入肝癌细胞系HepG2及宫颈癌细胞系HeLa细胞中，在荧光显微镜下观察荧光表达情况。加入GCV使总浓度分别为0、1．0、10．0和100．0μg／ml，用四甲基偶氮唑盐实验检测HSV-tk／GCV系统对各种细胞的杀伤作用，用RTPCR法检测转染前后胸苷激酶（tk）和EGFPmRNA的表达情况。用方差分析进行统计学处理。结果酶切鉴定和测序分析证实重组质粒构建成功；转染此穿梭质粒的细胞中仅有HepG2细胞检测到绿色荧光；RT-PCR检测到tk和EGFP的mRNA仅在HepG2细胞中表达；pDC316tkEGFP-CMV和pDC316-tkEGFPP4转染的HepG2细胞均出现明显的细胞生长抑制现象，两者转染细胞的抑制率分别为6．95％±0．67％、24．99％±1．53％、49．68％±1．68％和71．85％±3．28％，4．83％±0．35％、17．34％±1．15％、30．17％±1．30％和40．39％±0．82％，转染后者对HepG2细胞的抑制率低（F=24．055，P〈0．05），pDC316-tkEGFPCMV转染的HeLa细胞也出现明显的细胞生长抑制现象，其抑制率分别是6．36％±0．83％、23．95％±1．72％、45．13％±1．64％和69．38％±3．17％，转染质粒pDC316-tkEGFP-P4的HeLa细胞未发现明显的细胞抑制现象。结论成功构建IGF-ⅡP4启动子调控携带tk与EGFP融合基因穿梭质粒载体，转染后对人肝癌细胞系HepG2有选择性杀伤作用，为进一步靶向性肝癌腺病毒基因治疗奠定基础。

关键词：癌肝细胞胸苷激酶治疗

半胱天冬酶3前酶增强胞嘧啶脱氨酶-胸苷激酶融合双自杀基因系统治疗人卵巢癌的体外研究

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中华妇产科杂志 2005年第6期40卷 411-416页

作者：宋悦孔北华马道新曲迅江森山东大学齐鲁医院妇产科山东大学齐鲁医院肿瘤防治中心血液病研究室

目的探讨半胱天冬酶3前酶(procaspase3)能否增强胞嘧啶脱氨酶胸苷激酶/5氟胞嘧啶+更昔洛韦(CDTK/5FC+GCV)系统对人卵巢癌细胞的体外杀伤作用。方法构建procaspase3的表达载体pcDNA3casp3和人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子调控下的CDTK融... 详细信息

目的探讨半胱天冬酶3前酶(procaspase3)能否增强胞嘧啶脱氨酶胸苷激酶/5氟胞嘧啶+更昔洛韦(CDTK/5FC+GCV)系统对人卵巢癌细胞的体外杀伤作用。方法构建procaspase3的表达载体pcDNA3casp3和人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子调控下的CDTK融合双自杀基因表达载体pBTdel279CDTK。应用蛋白印迹法检测pcDNA3casp3和pcDNA3质粒转染后的3AO细胞(3AOpcDNA3casp3、3AOpcDNA3细胞)中procaspase3蛋白的表达情况;应用RTPCR技术检测pBTdel279CDTK和pBTdel279分别转染的3AOpcDNA3casp3和3AOpcDNA3细胞中CD和TK基因的表达情况;应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法、流式细胞仪技术、蛋白印迹法和荧光底物分析法分别检测4种细胞在CDTK/5FC+GCV系统作用后的细胞存活率、细胞周期及半胱天冬酶3(caspase3)活性。结果3AOpcDNA3casp3细胞有明显的procaspase3蛋白表达,而3AOpcDNA3细胞则无表达。3AOpcDNA3casp3和3AOpcDNA3细胞在pBTdel279CDTK转染后均可检测到CD和TK基因,但在pBTdel279质粒转染后则CD和TK基因表达均为阴性。在5FC+GCV作用下,3AOpcDNA3casp3+pBTdel279CDTK细胞的存活率显著低于3AOpcDNA3+pBTdel279CDTK细胞。在5FC(2mmol/L)+GCV(10μg/ml)作用48h后,3AOpcDNA3casp3+pBTdel279CDTK细胞的凋亡率为37.98%,S期比例为49.67%,分别高于3AOpcDNA3+pBTdel279CDTK细胞的21.34%和35.76%,两者分别比较,差异有统计学意义(P<0.05)。在5FC(1mmol/L)+GCV(1μg/ml)作用48h后,3AOpcDNA3casp3+pBTdel279CDTK细胞中的caspase3活性值为189.7,高于3AOpcDNA3+pBTdel279CDTK细胞的44.9,两者比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论procaspase3可显著增强CDTK/5FC+GCV系统对人卵巢癌细胞的杀伤作用。

关键词：胞嘧啶脱氨酶半胱天冬酶3 胸苷激酶双自杀基因体外研究系统治疗 caspase-3蛋白融合人端粒酶逆转录酶人卵巢癌细胞 CD-TK PCR技术检测四甲基偶氮唑蓝流式细胞仪技术蛋白印迹法 GCV系统体外杀伤作用 5-氟胞嘧啶

重组腺病毒-胸苷激酶基因对多种肿瘤细胞的杀伤作用

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癌症 2003年第12期22卷 1264-1267页

作者：周剑峰陈刚卢运萍王世宣马丁华中科技大学同济医学院同济医院肿瘤生物医学中心湖北武汉430030

背景与目的:以腺病毒为载体的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(adenovirusvector-mediatedherpessimplexvirus-thymidinekinasegene,ADV-TK)重组体是肿瘤基因治疗应用的主要方法之一,本文旨在鉴定自行构建的ADV-TK重组体的体外抗肿瘤活性。方... 详细信息

背景与目的:以腺病毒为载体的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(adenovirusvector-mediatedherpessimplexvirus-thymidinekinasegene,ADV-TK)重组体是肿瘤基因治疗应用的主要方法之一,本文旨在鉴定自行构建的ADV-TK重组体的体外抗肿瘤活性。方法:利用腺病毒载体将TK导入体外培养的14种不同组织源性的肿瘤细胞,再加入更昔洛韦(ganciclovir,GCV),用MTT法观察对肿瘤细胞的抑制效应。结果:ADV-TK剂量为每孔1×109病毒颗粒,在100μg/mlGCV底物浓度条件下,它对14种肿瘤细胞中的11种杀伤率达74%以上,而对人喉上皮癌细胞Hep-2、人肝癌细胞Bel-7402和人结肠癌细胞HCT-8敏感性稍差,分别为(55.3±2.0)%、(61.3±2.0)%和(63.7±2.5)%,ADV-TK对肿瘤细胞的抑制率除人喉上皮癌细胞Hep-2外,与相当于组织峰值药物浓度(5μg/ml)的化疗药物顺铂的效率相近。结论:ADV-TK重组体具有明确的体外抗肿瘤活性,有潜在临床应用价值。

关键词：重组腺病毒胸苷激酶基因肿瘤细胞杀伤作用